水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展

陈雅玲 包劲松

(浙江大学农业与生物技术学院原子核农业科学研究所,杭州310029;∗通讯联系人,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

水稻胚乳淀粉合成相关酶的结构、功能及其互作研究进展

陈雅玲 包劲松∗

(浙江大学农业与生物技术学院原子核农业科学研究所,杭州310029;∗通讯联系人,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

淀粉作为稻米最主要的储藏物质,其生物合成过程直接影响水稻的产量和品质。水稻淀粉的生物合成在造粉体中通过一系列酶促反应完成。本文综述了淀粉合成过程中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(BE)及淀粉脱支酶(DBE)的结构、功能以及各酶之间的相互作用的最新研究进展,以期为稻米品质改良提供理论参考依据。

水稻;淀粉合成;胚乳

稻米作为中国主要口粮,全国有60%的人口食用。全国除西藏和青海水稻种植面积较小外,其他各省均种植一定面积的水稻[1]。因此,稻米的产量和品质与人民生活水平的提高息息相关。杂交水稻育种已实现了水稻产量的大幅度提高,但是杂交稻的品质却不能满足广大群众的需求。稻米品质已成为稻米消费和各国育种学家的主要考虑因素。

淀粉作为稻米最主要的储藏物质,约占水稻种子总质量的80%～90%[2],其合成量的增加直接影响水稻的产量。而淀粉颗粒的理化特性如表观直链淀粉含量(AAC)、糊化温度(GT)、胶稠度(GC)、淀粉黏滞性(starch paste viscosity,又称RVA谱, RVA profile)及支链淀粉的结构等直接或间接影响稻米的食用及蒸煮品质[3,4]。因此,深入了解和研究水稻淀粉的生物合成过程,对水稻产量的提高和品质的改良具有重要意义。

水稻淀粉的生物合成在叶绿体或造粉体中通过一系列酶促反应完成,包括ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)、可溶性淀粉合酶(SSs)、淀粉分支酶(BEs)、淀粉去分支酶(DBEs)和淀粉磷酸化酶(PHO)[5,6]。GBSS催化直链淀粉的合成,SSs、BEs和DBEs共同完成支链淀粉的合成。目前,通过对水稻胚乳突变体材料的培育及研究,淀粉合成过程中相关酶的功能已基本确定。本文概述了水稻淀粉合成和积累过程中几个关键酶的功能及其相互作用研究的最新进展,以期为稻米品质改良提供理论参考依据。

1 水稻胚乳中淀粉合成途径

水稻淀粉合成包括瞬时淀粉合成和储藏淀粉合成两种形式。瞬时淀粉在白天积累,晚上降解为植物组织提供能量,主要合成场所在叶绿体中;而储藏淀粉能不断合成和积累,可作为种子发芽时的营养物质,主要合成场所在造粉体中。

在高等植物中,瞬时淀粉和储藏淀粉的合成过程具有很大的差别。在叶绿体中,通过卡尔文循环形成的磷酸丙糖(triose-P)或3-磷酸甘油酸(PGA)经磷酸丙糖转运蛋白(TPT)进入细胞质中,然后由一系列酶催化形成磷酸已糖(Hexose-P),最后用于蔗糖(surose)的合成(图1-A);而果糖-6-磷酸(F6P)则用于瞬时淀粉的合成。首先,F6P转换为葡萄糖-6-磷酸(G6P),而后在细胞质葡萄糖磷酸异构酶(PGI)和葡萄糖磷酸变位酶(PGM)作用下合成葡萄糖-1-磷酸(G1P),随后G1P在AGPase的催化作用下合成ADPG,ADPG作为淀粉合成相关酶的底物合成瞬时淀粉[7](图1-A)。储藏淀粉的生物合成以蔗糖为底物,蔗糖水解是储藏淀粉合成的第一步[7];来自叶片光合作用合成的或淀粉降解的蔗糖,经韧皮部运输至胚乳后,通过蔗糖转运蛋白进入细胞质基质,在蔗糖合成酶(SuS)催化下水解形成果糖(Fructose)和UDP-葡萄糖(UDPG),UDP-葡萄糖继而形成G1P;此外,蔗糖还可水解为己糖,经己糖转运子转运到胚乳细胞质中,再经变构酶、己糖激酶等转化成G1P;然后G1P在细胞质ADPGase的作用下形成ADPG;ADPG在由Brittle1基因编码的内包膜蛋白作用下进入造粉体中(图1-B)。Fettke等[8]研究发现,G1P可能通过假定的G1P转运蛋白直接进入造粉体,然后在AGPase催化下合成ADPG。由葡萄糖-1-磷酸形成的ADPG经GBSS催化合成直链淀粉,SSs负责延伸α-1,4糖苷键连接的葡萄糖链,而后由BEs形成分支,最后由DBEs去除不合适的分支完成支链淀粉合成(图1-C)。

2 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶

在高等植物中,ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化G1P和ATP形成ADPG和焦磷酸(PPi),是胚乳淀粉合成过程中的限速酶[9,10],直接决定淀粉的合成速率和淀粉累积水平。在水稻中, AGPase以异源四聚体(α2β2)的形式存在,由两个大亚基(LSs)和两个小亚基(SSs)组成[11,12](表1)。Dawar等[13]通过SWISS-Model Server网站(http://swissmodel．expasy．org)预测了水稻的AGPase结构,并利用SAVES网站(http://nihserver．mbi．ucla．edu/SAVES)对预测结构进行分析,发现LSs具有19个β链和15个α螺旋,SSs具有18个β链和15个α螺旋。对二聚体表面氨基酸、疏水作用及氢键研究可知,A链和B链之间有19个氢键和28个疏水分子连接,而A链和D链之间仅有4个氢键和15个疏水分子连接;相似的B链和C链之间有10个氢键和19个疏水分子连接,C链和D链之间的氢键和疏水分子最多,分别为27和38个[13](图2-A)。

图1 光合作用组织和非光合作用组织中淀粉合成途径和相关代谢[7]Fig．1．Schematic representation of the starch biosynthetic pathway and the related metabolism in photosynthetic and non-photosynthetic tissues[7]．

表1 水稻胚乳中淀粉合成相关基因、功能及表达特征Table 1．Function and expression pattern of starch synthesis genes in rice endosperm．

目前对水稻胚乳突变体的研究,LSs和SSs的功能也基本明确。SSs是酶的活性中心,与底物结合,参与催化和拟制作用,保守性高;而LSs是酶的调控中心,可以调节SSs对3-磷酸甘油酸和无机磷酸的变构效应来控制淀粉合成。在植物中,通过位于SSs的N末端区域的保守Cys12氨基酸的氧化还原反应形成二硫键来进行AGPase的变构调节[14]。在水稻胚乳中,细胞质中AGPase的LSs和SSs分别由Os AGPS2b和OsAGPL2基因编码;但是Os-AGPS2b编码的S2b亚单位缺少变构调节的保守氨基酸Cys12[15]。Tuncel等[15]对水稻胚乳的LSs进行点突变发现,位于LSs的N末端Cys47和Cys58控制AGPase的氧化还原反应,表明水稻胚乳中的AGPase酶活性主要由大亚基通过氧化还原调控小亚基共同决定。Tang等[16]利用酵母双杂交技术对水稻皱缩突变体w24进行研究,也发现OsAGPS 2b和OSAGPL 2存在着直接的相互作用控制淀粉的合成。因此,位于细胞质中的OsAGPSb和OsAGPL2对于正常水稻胚乳中AGPase活性和淀粉合成起着关键性作用。

图2 水稻淀粉合成相关酶3D结构Fig．2．3D structure of starch synthesis related enzymes in rice．

3 淀粉合酶

淀粉合酶是一类葡萄糖转移酶,以ADPG为底物,葡萄糖残基通过α-1,4糖苷键掺入寡聚糖引物的非还原末端,最终形成以α-1,4糖苷键连接的葡聚糖,葡聚糖又作为淀粉分支酶的底物合成支链淀粉[17]。淀粉合酶由多个基因编码,并形成多个共同体。根据其在淀粉体中存在的状态,淀粉合酶可分为颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(SS)。每一种淀粉合酶又有许多同工型,它们由不同的基因编码并在淀粉生物合成过程中承担着不同的角色。水稻淀粉合酶由GBSS、SSⅠ、SSⅡ、SSⅢ和SSⅣ5种类型组成(表1)。最新的研究数据显示,水稻和马铃薯可能具有SSⅤ类型[18]。

3．1 颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)

GBSS通过与淀粉颗粒特异性结合,参与直链淀粉的合成。水稻GBSS有两种同工酶,GBSSⅠ和GBSSⅡ;GBSSⅠ主要控制胚乳等贮藏器官中直链淀粉的合成[19],而GBSSⅡ主要控制根、茎、叶等营养器官中瞬时淀粉的合成[20]。将水稻GBSSⅠ的氨基酸序列提交到SWISS Model Server进行3D结构预测,并对预测的结构进行分析,发现水稻GBSSⅠ结构具有β片层、α螺旋和无规则卷曲;其中α螺旋可能负责物质运输和酶活性,而β片层可能负责酶的亚细胞定位[21](图2-B)。

在水稻中,GBSSⅠ由Wx编码,Wx位于第6染色体上,蛋白质大小为60 k D左右。大量研究表明,Wx外显子和内含子的结构发生改变,都将影响其表达量和蛋白质功能。目前在水稻中已经报道了7个Wx等位基因和7个功能位点,包括Wxb等位基因的第1内含子5′端剪切位点G/T突变[22]、wx等位基因的第2外显子23 bp碱基重复插入[23]、Wxop和Wxhp等位基因的第4外显子A/G突变[24,25]、Wxmq等位基因的第4外显子G/A突变和第5外显子T/C突变[26]、Wxin等位基因的第6外显子A/C突变[27]和第10外显子的C/T突变[28];这7个功能位点已被证实与稻米直链淀粉含量变化显著相关[29]。

此外,GBSS不仅与直链淀粉合成相关,而且还可能涉及淀粉颗粒中支链淀粉超长链(ELC)的合成。Hanashiro等[30]将GBSSⅠ基因导入w x水稻突变体中,发现ELC增加了7．5%～8．4%。水稻SSⅢa缺失突变体中,GBSSⅠ活性的增加伴随着大量高ELC含量的支链淀粉产生[31]。Teng等[32]研究也发现,Wx等位基因的差异还影响SSs、BEs以及PUL的活性,进而造成支链淀粉的结构和淀粉理化特性差异。因而,GBSSⅠ不仅负责催化直链淀粉合成,对支链淀粉的合成也有一定的影响。

3．2 淀粉合酶Ⅰ(SSⅠ)

利用离子交换色谱分析发现,从灌浆期水稻胚乳中提取的可溶性淀粉合酶存在两个主要的峰,SSⅠ和SSⅢ;说明SSⅠ和SSⅢ为胚乳中主要的SS酶,且SSⅠ活性显著高于SSⅢ,约占总SS活性的70%[33]。这一结果在小麦和玉米胚乳中也得到了证实。水稻的SSⅠ包含15个外显子和14个内含子,位于第6染色体上,与Wx距离仅5 cM。Takemoto-Kuno等[34]发现,SSⅠ活性在籼稻和粳稻品种中有显著差异,Native-PAGE揭示籼稻品种Kasalath中SSⅠ的活性只有粳稻品种日本晴的1/6甚至更少。Chen和Bao[35]利用Native-PAGE研究发现SSⅠ在不同水稻品种中具有酶谱多态性,且SSⅠ酶谱多态性可能由于氨基酸K438替换为氨基酸E438所导致;并对预测的日本晴和93-11的3D结构分析发现,这一突变位点不位于酶的催化区域(黄色和蓝色区域),但是与氨基酸残基结合区位于同一平面(图2-C)。

SS和BE重组系玉米胚乳中淀粉链长分布分析表明SSⅠ主要负责支链淀粉短链(聚合度为6～15)的合成[36]。玉米胚乳中SSⅠ更倾向于以短支链为底物,将其底物增加葡聚糖的链长时,SSⅠ的活性也显著下降,且发现大部分ADPG都被催化成了聚合度＜10的短链,说明SSⅠ主要控制A链和B1链的延伸[37]。在水稻中,Fujita等[38]通过Tos17逆转座子插入技术筛选获得SSⅠ缺失突变体ssI,在ssI的胚乳中,支链淀粉聚合度为8～12的链降低,聚合度为6～7和16～19的链增加,而长链聚合度不小于21的比例基本不变,表明SSⅠ延伸聚合度为6～7的A链或者B链形成聚合度为8～12的链。进一步研究发现,SSⅠ活性的完全缺失并不影响淀粉颗粒的大小和直链淀粉含量,也不影响淀粉颗粒晶体结构的形成,说明具有其他SS能够补偿SSⅠ功能的缺失或降低。

3．3 淀粉合酶Ⅱ(SSⅡ)

水稻中具有3个SSⅡ同工酶,即SSⅡa、SSⅡb和SSⅡc,分别位于水稻的第6、2和10染色体上。SSⅡa也称为SSⅡ-3或ALK,在水稻胚乳中特异性表达;SSⅡb也称为SSⅡ-2,在叶片中特异性表达,可能与瞬时淀粉合成相关;SSⅡc又称为SSⅡ-1,主要在胚乳中低丰度表达[39]。3个水稻SSⅡ同工酶相互之间的氨基酸同源性为51%～64%,与其他植物SSⅡ蛋白有52%～73%的同源性[39]。

Umemoto等[40]研究表明,SSⅡa的等位基因差异是导致粳稻日本晴和籼稻Kasalath胚乳支链淀粉链长分布差异的最主要原因。Nakamura等[33]研究证明,栽培稻支链淀粉结构可分为L-型和S-型,L型主要存在于籼型品种中,大多数粳型品种为S-型;S-型支链淀粉具有较多的短链(DP 6-10)和较少的中长链(DP 12-24),而长链B2和B3链的比率没有明显的差异;在蛋白水平上,籼稻的SSⅡa活性显著高于粳型品种。通过转基因技术,将籼型品种IR36的SSⅡa的cDNA导入粳型品种中,聚合度＜11的链减少,聚合度为13～25的链增加,支链淀粉从S-型转换成L-型[33]。

大量的研究也表明,在植物胚乳中,SSⅡa通过延长支链淀粉短链聚合度≤10合成中链聚合度为12～24[41,42]。Fujita等[43]将高活性的籼稻SSⅡaicDNA导入isa1突变体中,发现SSⅡai/isa1转基因系中聚合度大于30的链增加,且SSⅡa能延伸α-葡聚糖链。Wang等[44]对具有不同SSⅡa等位基因的水稻育种系材料进行淀粉结构及糊化温度分析,发现SSⅡa能合成中长链(聚合度为16～21),进而影响淀粉的糊化温度。这些研究结果表明SSⅡa通过延长A链和B1链合成中长链,不形成B2链或者更长的链,且直接影响淀粉的理化特性。

3．4 淀粉合酶Ⅲ(SSⅢ)

在水稻胚乳中,SSⅢ活性是仅次于SSⅠ的第二大类淀粉合酶。水稻中已克隆到2个SSⅢ基因SSⅢa和SSⅢb,分别位于第3和第8染色体上,其中SSⅢa主要存在于胚乳中,SSⅢb在叶片中表达[11]。Fujita等[38]从水稻胚乳中分离纯化获得SSⅢa酶,其在离体条件下能够以糖原为引物,延伸链长为聚合度为≤11的链合成长链。对水稻SSⅢa缺失突变体ssⅢa研究发现,其淀粉颗粒结构松散,导致白色中心粉质胚乳的形成,相较于野生型,ssⅢa胚乳中支链淀粉聚合度为6～9、16～19和33～55的链减少,而聚合度为10～15和20～25的链增加[31]。Li等[45]对大麦ss3a突变体(amo1)胚乳支链淀粉链长分布研究表明,短链聚合度为9～10减少,聚合度为15～24的链增加,而长链基本没有变化。这些结果说明SSⅢa的功能主要是利用中长链合成支链淀粉聚合度聚合度＞30的长链。此外, SSⅢa活性的缺失会导致内源SSⅠ活性的增加,进而促进聚合度为9～15和22～29的链合成。对玉米SSⅢa突变体dull的研究发现内源SSⅠ活性高于野生型,与水稻结果类似[46]。最近对水稻高抗性淀粉(RS)突变体的研究发现,SSⅢa基因突变后显著提高了水稻胚乳中抗性淀粉、直链淀粉、脂类、直链淀粉-脂质复合体含量以及糊化温度;进一步研究发现,SSⅢa对RS的调控依赖于Wxa的高水平表达[86]。因此,可以推断SS亚型之间存在互作,可以对部分不具功能或功能不足的SS亚型进行功能补偿。

3．5 淀粉合酶Ⅳ(SSⅣ)

目前为止,人们对SSⅣ在谷物中对葡萄糖链长的作用知之甚少。Hirose和Terao[39]在水稻中发现SSⅣ有二种同工型SSSⅣa和SSSⅣb,且它们在水稻生长的整个阶段表达相对稳定,表明其在胚乳淀粉合成过程中具有一定的作用。Roldán等[47]从拟南芥中获得SSⅣ突变体,其胚乳直链淀粉与支链淀粉的比率基本不变,且支链淀粉链长分布也未发生变化,但是拟南芥胚乳中淀粉颗粒数量急剧下降,颗粒大小增加,说明SSⅣ可能涉及淀粉颗粒的形成及控制淀粉颗粒数量。Toyosawa等[48]发现SSⅣa或者SSⅣb基因突变对水稻胚乳中淀粉颗粒特性影响不大,在ss4b/ss3b双突变体中淀粉颗粒的数量和种子中淀粉含量变化不大,但是淀粉颗粒的形态由规则的多边形变成了球形,表明SSⅣ在淀粉颗粒的形成中具有重要的作用。

4 淀粉分支酶

淀粉分支酶(BE)是合成支链淀粉的关键酶,主要作用是切开α-1,4糖苷键连接的葡聚糖,然后转移断裂的链将其还原末端连接到C6羟基上形成α-1,6糖苷键从而产生支链淀粉的分支结构。根据淀粉分支酶的生物化学特性,水稻中的BE有BEⅠ和BEⅡ两种亚型(表1)。

4．1 淀粉分支酶Ⅰ(BEⅠ)

基于玉米BEⅠ和BEⅡ体外E．coli表达实验发现,BEⅠ倾向于形成聚合度大于16的长链,而BEⅡ产生聚合度小于12的短链[49]。对水稻BEⅠ突变体sbeⅠ研究发现,其胚乳中支链淀粉长链(聚合度大于37和聚合度为12～21)显著下降,而短链(聚合度小于10)和中长链(聚合度为24～34)增加,表明水稻BEⅠ可能主要用于B1链的合成,形成B链的簇状结构[50]。此外,sbeⅠ突变体胚乳淀粉相较于野生型具有更低的起始糊化温度,这一结果支持支链淀粉具有中高比例的长链会增加糊化的难度[31,51]。Nakamura等[52]研究发现,BEⅠ通过分枝内层及外层葡萄糖链形成短链及聚合度不小于40的中长链。

成熟的BEⅠ蛋白由755个氨基酸残基组成,属于GH13家族蛋白;BEⅠ结构由3个模块组成,分别为碳水化合物结合区域48(CBM48)、中心催化区域(GH13)、C末端α-淀粉酶区域。BEⅠ中高度保守的氨基酸残基Tyr235、Asp270、His275、Arg342、Asp344、Glu399和His467为假定的催化活性氨基酸残基;尤其是Asp344和Glu399非常接近于糖苷键,进一步确定其为活性中心[53](图2-D)。

4．2 淀粉分支酶Ⅱ(BEⅡ)

水稻中具有两种BEⅡ同工型,BEⅡa和BEⅡb,BEⅡa在不同组织中均有存在,BEⅡb仅在胚乳中表达。水稻BEⅡa缺失突变体be2a胚乳中,支链淀粉链长分布相较于野生型没有显著的改变。由此推测,BEⅡa可能对其他BE同工型具有辅助作用。Nishi等[54]分离鉴定获得水稻BEⅡb突变体Amylose-Extender(ae突变体),支链淀粉长链聚合度≥35(B2和B3链)和中长链(聚合度为15～30,A链和B1链)显著增加,短链(聚合度为6～12)显著减少。Nakamura等[52]研究发现BEⅡb专一的转移聚合度6和聚合度7的链。利用RNA干扰技术,沉默水稻BEⅡb基因,导致表观直链淀粉含量显著增加,直链淀粉含量最高可增加47．61%[55]。在水稻ae/w x双突变体胚乳中,不仅无直链淀粉,而且产生更多的长链,少量的聚合度不大于17的链,而聚合度为8～12的链也大幅度减少。这些数据表明BEⅡb在支链淀粉A链的合成过程中起着重要的作用。

5 淀粉脱分支酶

淀粉脱分支酶(DBE)能特异性地水解淀粉中的α-1,6糖苷键,在氨基酸序列上与α-淀粉酶相似,属于淀粉水解酶家族。根据DBE作用底物不同,可分为两大类(表1):一类是异淀粉酶(ISA),ISA以变性支链淀粉、糖原和支链淀粉类似物为底物,特异去除其α-1,6糖苷键,不能作用于极限糊精和普鲁蓝;另一类是普鲁蓝酶(PUL),PUL以极限糊精和普鲁蓝等为底物,特异去除其α-1,6糖苷键。

5．1 异淀粉酶(ISA)

水稻ISA有3个同工型,ISA1、ISA2和ISA3, ISA1在胚乳发育早期表达,ISA2在叶片和胚乳中均有表达,ISA3在胚乳中表达量较低,主要在叶片中表达[11]。对水稻ISA1突变体sug1研究发现ISA的表达与支链淀粉聚合度小于12的链长比例有关[56]。将正常的水稻ISA1基因导入突变体sugary-1中,突变体表型转换为野生型[57,58]。ISA2缺少酶催化位点,生物化学研究揭示ISA2可能与ISA1形成异源复合体后起催化作用。Utsumi等[58]研究发现,在水稻胚乳中,只有ISA1同源复合体在淀粉合成过程中具有功能,异源复合体不具有功能,但是在叶片中ISA1-ISA2异源复合体也参与淀粉合成,且比ISA1同源复合体更适应高温(40℃)条件下淀粉的合成。朱立楠等[59]对5个直链淀粉和支链淀粉含量不同的粳稻品种胚乳发育过程中ISA基因表达量和活性研究发现,ISA1在整个胚乳发育过程中的表达量明显高于ISA2,且ISA1的基因表达量、酶活性与支链淀粉含量正相关。这些研究表明,ISA对支链淀粉的正确合成具有重要的作用,包括剪切支链淀粉的过分支或者移除不当分支,保证支链淀粉簇状结构的形成。

5．2 普鲁蓝酶(PUL)

在水稻中,PUL基因位于第4染色体上,在整个灌浆过程中都有较高水平的表达,同时在灌浆的中后期达到峰值[60]。Fujita等[61]研究发现水稻PUL缺失突变体聚合度为13～29的链降低,聚合度小于12的短链增加,但其增加幅度要低于sugl突变体;但pul/sugl双突变体聚合度小于7的短链增幅则高于sugl突变体。玉米PUL突变体zpul-204的胚乳结构和组成相较于野生型并没有明显不同,但其sul/zpul-204双突变体胚乳中大量积累植物糖原。这些研究结果表明,在胚乳淀粉合成过程中,PUL可能对ISA起到补偿作用。

最近的研究表明,PUL与稻米淀粉的理化特性具有显著的相关性。Tian等[62]研究发现PUL+ 885的SNPs对直链淀粉的含量具有微效的影响。Yan等[63]分析了118份糯稻中17个淀粉合成相关基因发现,10个淀粉合成基因涉及控制RVA谱特性,其中PUL与PKV、HPV、CPV、BDV和PT显著相关。Kharabian-Masouleh等[64]对233份水稻淀粉合成相关基因进行测序,并将获得的SNPs与淀粉理化特性进行关联分析发现,PUL的两个SNP与PT、GT和CHK有相关性。Yang等[65]研究发现,在以SSⅡa的GC/TT SNP为协变量条件下,PUL为HD的主效位点。这些研究结果表明, PUL在水稻淀粉合成过程中具有重要的作用。

6 淀粉合成相关酶之间的互作

图3 水稻中淀粉合成相关酶之间的关联网络Fig．3．Potential association networks of starch synthesis enzymes in rice endosperm．

淀粉合成相关酶之间的互作在小麦、大麦、玉米胚乳中早已被发现。在小麦胚乳中,SSⅠ、SSⅡa和BEⅡa或BEⅡb形成约260 k D的蛋白质复合物参与淀粉的合成[66]。Liu等[67]研究发现,在玉米胚乳中,SSⅠ、SSⅡa和BEⅡb形成主要的蛋白复合物,并可能与BEⅡa形成分子量更大的复合物。利用凝胶渗透色谱法能分离到约670 k D包括SSⅠ、SSⅡa、BEⅡa、BEⅡb和SSⅢ的较大蛋白质复合物,进一步研究显示BEⅡb在复合物中呈磷酸化状态[67,68]。在玉米ae突变体胚乳中野生型蛋白复合物(SSⅠ、SSⅡa和SBEⅡb)被由SSⅠ、SSⅡa、SBEⅠ、BEⅡa和PHO1组成的新的复合物代替,且SBEⅠ和SP都被磷酸化了[67]。Liu等[69]利用新的玉米ae突变体研究发现,BEⅡb活性的缺失导致胚乳淀粉中形成SSⅠ、SSⅡa和BEⅠ复合体, PHO1不参与形成复合体。

将水稻胚乳淀粉合成过程中主要的淀粉合成相关酶氨基酸序列提交到STRING网站(http:// string-db．org)预测其蛋白质之间的互作,发现SSs、BEs和DBEs之间可能存在互作,但未得到实验验证(图2)。近年来,对水稻胚乳中淀粉合成相关酶之间的互作也已从体内和体外实验中得到证实。Bao等[70]对稻米淀粉直链淀粉含量(AAC)和糊化温度(GT)的研究发现,低AAC水稻具有高或低GT,高AAC水稻具有中或低GT;推测控制AAC的酶GBSSⅠ与控制GT的酶SSⅡa之间可能存在互作;并假定了一个SSⅡa和GBSSⅠ互作模型。Nakamura等[71]研究证明纯化的水稻PHO1与BEⅠ、BEⅡa或者BEⅡb复合物具有功能互作。Nakamura等[72]在体外对水稻SS和BEs酶促反应进行研究发现,SSⅠ酶促反应能被BEs所促进,BEs活性也能被SSⅠ所促进,说明SSⅠ和BEs具有相互作用。Crofts等[73]利用凝胶渗透色谱、免疫共沉淀等方法,对日本晴胚乳中淀粉合成相关酶进行分析发现,＞700 k D的蛋白复合物中包括SSⅡa、SSⅢa、SSⅣb、BEⅠ、BEⅡb和PUL,200～400 k D的蛋白复合物中包括SSⅠ、SSⅡa、BEⅡb、ISA、PUL和Pho1,免疫共沉淀揭示SSs-BEs、BEⅡa-Pho1以及DBE-BEⅠ形成蛋白复合物。Chen和Bao等[35]研究发现,SSⅠ与PUL,SSⅠ与BEs,PUL与BEs具有互作,且日本晴和93-11胚乳中蛋白质互作模式不同。尽管水稻胚乳中淀粉合酶之间已确定能形成蛋白质复合物,但这种复合物的形成所起的作用还没有被完全了解。蛋白质复合物的形成提高了淀粉合成效率,因为一个反应的产物作为下一个反应的底物时可以在复合物内部很快传递(底物运输通道),但是具体的机制还有待进一步的研究。

7 展望

淀粉代谢途径研究一直受到广泛的关注,随着分子生物学、遗传学、生物化学以及结构分析等方法的应用,水稻淀粉生物合成过程中涉及到的关键酶的结构、功能及互作已基本明确,但是对于淀粉合成相关酶是如何与葡萄糖链进行互作以及淀粉合成相关酶复合体是如何参与淀粉的生物合成过程,所知甚少。淀粉合成相关酶是通过不同的方式与环境中的葡萄糖链相互作用,如GBSS、BEⅡb以及SSⅠ通过紧密或松散的方式结合于淀粉颗粒的不同位置,进而与葡萄糖链互作;但是一些酶如DBEs几乎完全溶于基质中,以非共价的方式与碳水化合物结合,因而对其如何与葡萄糖链相互作用的机制还需要更多的体内或体外分析数据进行阐明。此外,淀粉合成过程还受一些调控因子的调节,如flo2编码一种具有RPT结构蛋白调节淀粉合成相关基因的表达[74];flo6编码具有CBM48结构域的蛋白,与ISA1结合调控淀粉合成[75];锌指蛋白OsbZIP58能激活水稻淀粉合成,影响淀粉颗粒数量以及改变短链和中长链比例[76];而这些调控因子之间是否存在联系,淀粉合成过程中是否存在调控网络对其基因及蛋白质进行调节还未可知,有待进一步的研究。

淀粉合成相关基因已成功应用于分子标记辅助育种筛选优质稻米中的优异基因。利用分子标记已经培育出一系列含低直链淀粉含量基因Wx-mq的优良食味粳稻品种如Milk Queen、关东194、南粳46、南粳9108等[77-79]。杨瑞芳[80]利用控制水稻抗性淀粉合成的主效基因sbe3-rs进行分子标记辅助育种获得了3个高产和优质的抗性淀粉水稻。但是,目前开发获得的淀粉合成相关基因的分子标记仍较少,优质水稻的培育仍需较多的分子标记进行辅助育种。

在过去的几十年,全球环境逐渐变暖;在水稻种植的季节里,最高温和最低温平均每10年分别升高0．3℃和0．2℃[81]。环境的恶化对水稻的产量和品质具有重大的冲击。Liu等[82]研究发现,高温会增加垩白率,降低水稻产量、直链淀粉含量以及总淀粉含量。Chen等[83]研究也发现,短期的高温增加了垩白率,使得淀粉颗粒变得松散,增加了单个淀粉颗粒。最近的研究表明,淀粉合成过程中相关基因如GBSS、BEⅠ和BEⅡb在高温条件下下调表达[84,85]。然而在高温条件下,垩白率的增加及淀粉颗粒的变化与淀粉合成相关基因有何关联,其分子机制仍不清楚;是否存在新的淀粉合酶复合体介导高温下淀粉合成也待进一步的研究。因而,在越来越严峻的环境条件下,以水稻为研究对象,阐明水稻淀粉的合成分子机制,对于提高水稻产量、改良稻米品质,提高中国农业竞争力,具有重要的意义。

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Progress in Structures,Functions and Interactions of Starch Synthesis Related Enzymes in Rice Endosperm

CHEN Yaling,BAO Jinsong∗
(Institute of Nuclear Agricultural Science,College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310029, China;∗Corresponding author,E-mail:jsbao＠zju．edu．cn)

Starch is the predominant rice seed reserves．Rice yield and eating quality are influenced by the process of starch biosynthesis．In endosperm amyloplast,starch biosynthesis is a result of complex network of many enzymes．This report summarized the structures,functions and interactions of ADP-glucose pyrophosphorylase(AGPase), starch synthases(SSs),starch branching enzymes(BEs)and starch debranching enzymes(DBEs)．It will provide helpful information to breed high yield and good quality rice．

rice;starch synthesis;endosperm

Q944.46;S511.01

A

1001-7216(2017)01-0001-12

2016-09-30;修改稿收到日期:2016-11-1。

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2016XZZX001-09);浙江省自然科学基金资助项目(LZ13C130001)。