鲭科鱼类活性肽的酶法制备及其生理功能研究进展

向泽敏， 葛俊驿， 邱晓挺， 严小军

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 宁波 315211)

鲭科鱼类活性肽的酶法制备及其生理功能研究进展

向泽敏， 葛俊驿， 邱晓挺， 严小军

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室， 宁波 315211)

鲭科鱼类作为重要的海洋经济种类，资源丰富，是食源性蛋白的重要来源，但目前对其综合利用却徘徊在较低水平。酶解鲭科鱼类蛋白以制备具有抗氧化、降血压、免疫、抗菌等作用的活性肽是将鲭科鱼类进行高附加值利用的一条有效途径。就酶解鲭类蛋白质制备活性肽的工艺条件、活性肽常见的分离纯化和序列鉴定方法、活性肽的主要生理功能等方面的研究进展进行综述，讨论了酶法制备活性肽的研究中所面临的问题和相应对策，并对其应用前景予以展望。

鲭科；活性肽；酶法制备；分离纯化；生理功能

鲭科(Scombridae)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)、鲈形目(Perciformes)、鲭亚目(Scombroidei)，是一类海洋中上层洄游性鱼类。其中鲭属(Scomber)、金枪鱼属(Thunnus)、马鲛属(Scomberomorus)、羽鳃鲐属(Rastrelliger)和鲣属(Katsuwonus)为鲭科中较常见的重要经济种类，广泛分布于全球各大洋的温带及热带海域[1]。鲭科鱼类具有生长快、产量高及营养丰富等优点。然而，除鱼肉直接食用或被加工成低值的生鱼片或罐头等外，大量副产物通常会被丢弃。其综合价值尤其是许多生物活性物质均未得到充分开发与利用，造成了一定的资源浪费和环境污染[2]。

水解蛋白质制备活性多肽是一条将鲭科鱼类进行高附加值利用的有效途径。活性肽的研究已成为当前生物活性物质开发的热门领域之一。现有研究表明活性肽具有多种生理功能，如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抗血栓、抗菌、免疫等，可以作为潜在的药物、保健品和食品防腐剂。活性较高的多肽通常由2到20个氨基酸残基组成，分子质量一般小于6000 u，而生物体内天然存在的活性肽含量低，分离纯化困难，难以实现规模化生产[3]。近年来，酶解技术在海产品蛋白深加工中被广泛使用，其水解效率高、条件温和可控、无副反应、适用面广、酶用量少且来源广，与酸碱降解相比具有无可比拟的优势[4]。如今，许多现代分离纯化及结构鉴定手段已高效广泛地应用于海洋功能活性肽的研究中[3]。

本文概述了酶法制备鲭科鱼类蛋白活性肽的工艺、分离纯化及结构鉴定和活性肽生理功能方面的研究进展，以期为鲭科鱼类蛋白的高值化利用及其活性肽功能开发的进一步研究应用提供科学依据。

1 酶法制备鲭科鱼类活性肽及其鉴定

1.1 活性肽酶法制备的工艺条件

蛋白酶水解是最快速、最安全、最易操控的制备活性肽的方法之一，它不但能改善蛋白的生理功能，而且能提高副产物的利用率，减少浪费与污染。蛋白酶种类繁多，不同蛋白酶具有不同的催化位点，形成的肽或氨基酸也有所不同，从而获得具有不同功能的活性肽[3]。影响酶解效率和目标多肽得率的因素主要包括蛋白酶种类的选择、酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值和反应时间等，因此，需要对酶解工艺条件进行优化。表1 列举了部分研究酶解鲭科鱼类蛋白的工艺条件。由表1可知，同种原料的酶解选择指标不同，最佳蛋白酶的选择也不同；酶解指标相同，因底物不同，酶选择也会有所不同；其他条件均相同时，双酶酶解的效果一般优于单酶解：酶解时间缩短，酶用量减少，多肽得率提高；当其他条件相同，更精准的优化方法会带来更优的酶解条件[5-8]。

表1 酶解鲭科鱼类蛋白的工艺条件Table 1 Optimization of enzymatic hydrolysis of Scombridae fishes

E： 酶用量；S：底物用量；E/S：酶用量与底物用量之比

1.2 活性肽的分离纯化

粗酶解液成分复杂，除含多种肽类外，还有未水解的大分子蛋白和游离氨基酸的存在，故需对其进行分离纯化。常用于鲭科鱼类的方法主要有：超滤法、凝胶过滤层析、离子交换层析和高效液相色谱。

超滤法(Ultrafiltration，UF)是利用截流不同分子质量的超滤膜对酶解液进行分段来分离出理想分子质量大小的肽段。刘哲[9]采用截留分子质量为10 000 u 和5000 u 的UF 膜对马鲛鱼(Scomberomorusniphonius)鱼肉酶解物进行超滤分离，通过截留样品中的大分子物质实现对小分子物质的富集，使得小于5000 u 的多肽组分活性最高。

凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)是一种以分子大小和形状差异来分离样品中各个组分的色谱分离法。Guerard 等[10]应用Superdex Peptide HR 10/30 GFC 柱分析了不同水解度的黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacares)胃蛋白酶解物的分子质量分布情况。

而酶解物粗品中，副产物较多，影响活性肽组分的因素也较多，单一的分离纯化方法往往很难得到较高纯度的产品，普遍采用两种或两种以上分离分析技术联用的手段。Nguyen 等[11]采用Superdex Peptide 10/300 GL GFC 柱结合高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对黄鳍金枪鱼酶解物组分进行了有效的分离纯化。Wang 等[12]通过UF、离子交换柱SP Sephadex C-25、GFC 柱Sephadex G-25 和HPLC 色谱柱TSK gel 3000 PWXL 一系列连续分离技术，应用活性追踪法最终从鲐鱼(Pneumatophorusjaponicus)水解液中纯化出一个1664 u 的抗氧化肽。

1.3 活性肽序列鉴定

多肽序列中氨基酸的排列顺序决定其空间结构及功能特性，因此序列鉴定是活性肽的重要表征手段。鉴定鲭科鱼类活性肽序列的方法主要为质谱法和Edman 降解法。质谱法(Mass Spectrometry，MS)是将待测物质离子化，按离子的质荷比分离，测定各种离子谱峰的强度，通过对质谱中的分子离子峰和碎片离子峰等分析，来求其相对分子质量并推测结构的方法。Je 等[13]自大眼金枪鱼(Thunnusobesus)暗色肉的胃蛋白酶解液中分离到一个抗氧化肽，通过Q-TOF MS谱图的分子离子峰确定肽的分子质量为1222 u，串联质谱分析序列为Leu-Asn-Leu-Pro-Thr-Ala-Val-Tyr-Met-Val-Thr。利用基于经典Edman 降解法的蛋白质多肽测序仪对多肽N 端进行序列测定目前也较为普遍。谭洪亮等[14]从金枪鱼鱼骨胶原蛋白酶解物分离纯化得到一个抗氧化的10AA，经蛋白质序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Gln-Gly，ESI-MS 检测确定其分子质量为839.87 u。

2 鲭科鱼类活性肽的生理功能

2.1 抗氧化功能

肽的抗氧化机制是通过清除体内氧化反应中产生的具有强氧化性对人体有害的氧自由基、羟自由基来发挥作用。近年来大量国内外研究表明，海洋鲭类蛋白活性肽具有较好的抗氧化活性。Chi 等[15]探讨了分别从鲣鱼(Katsuwonuspelamis)暗色肉的中性蛋白酶酶解物和碱性蛋白酶酶解物分离得到的13个和18个活性肽的氨基酸组成和序列对其抗氧化作用的影响，研究证实，多肽较低的分子量、疏水性芳香族氨基酸残基的存在及特定氨基酸序列是影响多肽抗氧化活性的关键因素。不同鲭科物种的蛋白经不同蛋白酶酶解纯化获得的抗氧化多肽的序列结构，见表2。

表2 鲭科鱼类抗氧化多肽的序列Table 2 The sequences of antioxidant peptides of Scombridae fishes

注：Protease XXIII、MICE 和Orientase 分别来源于曲霉属真菌、鲭鱼盲肠和枯草芽孢杆菌

2.2 降血压功能

肽的降血压作用是通过抑制血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性来达到降血压的功效。1993 年Matsumura 等[21]最先从鲣鱼酶解物中分离到6个ACE 抑制活性的肽，其中包括5个三肽和一个四肽，通过体外ACE 半抑制浓度(inhibitory concentration 50%，IC50) 实验显示，具有较强ACE 抑制活性的肽均为三肽，均由疏水性氨基酸组成且C 端均为 Pro。近年来，一些研究报道了金枪鱼蛋白活性肽具有高效的ACE 抑制作用，并对其进行序列测定(表3)，发现通常C 端具有Pro 或Trp、Tyr、Phe 等芳香族氨基酸，N 端为支链脂肪族氨基酸的肽易与ACE 结合，从而抑制其活性。Martinez Alvarez 等[26]借助体外模拟肠道消化作用研究，提高金枪鱼副产物酶解组分的ACE和寡肽酶抑制活性。

表3 金枪鱼ACE 抑制肽的序列Table 3 The sequences of ACE inhibitory peptides of tuna

—：未检测

2.3 免疫功能

免疫活性肽是生物体内的一种细胞信号传递物质，通过内分泌、神经分泌等作用方式行使功能，生物体内含量较低、结构多样。纪丽娜[27]利用小鼠脾淋巴细胞增殖反应，追踪分离金枪鱼头酶解物免疫活性组分，采用噻唑蓝MTT 比色法、中性红实验、Griess 法和酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)分别测定免疫组分对小鼠腹腔巨噬细胞代谢活性的影响、吞噬功能的影响、释放NO 的影响和分泌肿瘤坏死因子、白介素-6 的影响，结果显示，在一定剂量范围内活性肽组分可显著促进巨噬细胞的增殖且无细胞毒害。

2.4 其他功能

除以上生理功能外，鲭类活性肽还具有降血脂、抗菌、抗疲劳活性和铁结合能力。王玉明等[28]研究鲣肝脏水解物对大鼠脂肪代谢的影响，结果表明，鲣肝脏水解物能降低血液和肝脏中引起动脉粥样硬化以及脂肪肝的甘油三酯浓度。Ennaas 等[29]从鲭鱼(Scomberscombrus)副产物的复合酶酶解物中分离到4个抗菌肽，其中序列为Ser-Ile-Phe-Ile-Gln-Arg-Phe-Thr-Thr的肽对革兰氏阳性菌Listeriainnocua和革兰氏阴性菌E.coli均具有较好抗菌活性的抑菌作用。Wang 等[30]对鲐鱼酶解物中分离得到小于2500 u 的组分进行小鼠体内抗疲劳试验，在观察小鼠生理指标变化时发现，其在一定程度上可以缓解小鼠疲劳症状且推断其抗疲劳作用机制可能与其抗氧化效应有关。王攀峰等[31]从马鲛鱼加工副产物中制备纯化得到3个不同的铁结合肽段，其氨基酸序列和分子质量分别为Asn-Pro-Val-Arg-Gly-Asn(656.104 u)、Asn-Pro-Asp-Arg-Gly-Asn(672.079 u)和Ser-Thr-Tyr-Glu-Leu-Thr-Phe(861.104 u) 。前两者较强的铁结合力可能与含Asn 和Pro 量较高有关，后者可能由于Thr 含量较高有关。铁结合肽将有助于新型铁制剂的研发，可能对缺铁性贫血有辅助治疗作用。

3 讨论

海洋中的鲭科鱼类资源丰富，具有很高的营养价值，尤其富含蛋白质和生理活性物质。来自鲭科鱼类蛋白质的活性肽在食品、医疗等多方面具有广阔的应用前景。运用低成本、高效率、低污染的可控酶解技术制备鲭类蛋白活性肽的研究已取得较大进展，但在今后的研究中仍存在一定问题，亟待探讨与解决。

首先，选择合适的蛋白酶是首要任务，许多已知的商业蛋白酶已得到广泛应用，但利用具有特异切割位点和切割特性的新型蛋白酶酶解鲭类蛋白制备活性肽的报道并不多见。目前，大多商业蛋白酶酶活的最适温度一般在30°C 以上，可能会对多肽的活性产生一定影响，可考虑采用基因重组表达特定的蛋白酶[32]或从海洋微生物的代谢产物中分离低温蛋白酶[33]作为水解工具。要获得更多结构新颖、功能特异的活性肽，必须着力开发新型工具蛋白酶。

其次，酶解工艺技术也是整个研究的重要环节。由于酶解体系较复杂，影响因素甚多,寻找一个高精度的优化模型，如利用正交、响应面结合神经网络模拟[34]，并建立一套高效的酶解工艺优化机制就显得尤为重要。

再次，活性肽的分离纯化及序列鉴定的研究仍面临极大挑战。鉴于酶解物成分复杂、存在分子质量、极性及其他性质相近的不同肽类，合理选择有效的技术路线从酶解物中高效分离到纯度较高、活性良好的多肽方面的研究有待加强。而且，应研究出更有效的多肽序列鉴定策略，解决可能会因非标准氨基酸的存在或肽内部环化而致的测序失败[9]问题。此外，加深对活性肽的序列结构研究，分析其间构效关系[35]，可为将来实现定向获取活性肽创造可能。

最后，鲭类蛋白活性肽虽已有抗氧化、抗高血压、免疫等活性方面的研究，但关于抗肿瘤、降血糖等更多生理作用的研究还存在欠缺，可通过后期的化学结构的修饰技术赋予或改善其功能[31]，定向获得目标活性肽。同时活性肽的具体作用机理和途径尚未完全明确，且其活性测定现仅局限于体外和小鼠实验，安全性及有效性仍需通过药理学研究来论证。

综上所述，鲭科鱼类蛋白活性肽可能会成为功能食品和医药的有效成分，其多种活性使其具有作为食品添加剂、营养保健品或药物等有效成分的极大潜力。国内已有鲭科金枪鱼多肽蛋白试产和鲐鱼多肽功能饮料等初步商业化应用研究，尽管与国外发达国家相比仍存在较大差距，但随着我国科研工作者对鲭科鱼类的深入研究和新技术的引进，相信国内未来鲭科鱼类活性肽的产业化工作必将取得突破性进展。

[1]PUNCHER G N, ARRIZABALAGA H, ALEMANY F, et al. Molecular iadentification of Atlantic Bluefin Tuna (Thunnusthynnus, Scombridae) larvae and development of a DNA character-based identification key for Mediterranean Scombrids[J].Plos One, 2015, 10(7) :e0130407.

[2]ERDAIDE O, LEKUBE X, OLSEN R L, et al. Comparative study of muscle proteins in relation to the development of yake in three tropical tuna species yellowfin (Thunnusalbacares), big eye (Thunnusobesus) and skipjack (Katsuwonuspelamis) [J]. Food Chemistry, 2016, 201: 284-291.

[3]LEMES A C, SALA L, ORES J D C, et al. A review of the latest advances in encrypted bioactive peptides from protein-rich waste[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(6)：950.

[4]CASTRO R J S D, SATO H H. Biologically active peptides: processes for their generation, purification and identification and applications as natural additives in the food and pharmaceutical industries[J]. Food Research International, 2015, 74: 185-198.

[5]WANG P, HUANG G, JIANG J. Optimization of hydrolysis conditions for the production of iron-binding peptides from mackerel processing byproducts[J]. Advance Journal of Food Science and Technology, 2013, 5(7): 921-925.

[6]杨龙方, 桑卫国, 段清源. 响应面法优化鲣鱼褐色肉酶解工艺的研究[J]. 食品工业科技, 2015, 36(12): 175-180.

[7]刘建华, 王 斌, 郐 鹏, 等. 金枪鱼暗色肉酶解工艺及其水解物营养价值评价[J]. 食品科学, 2014, 35(20): 1-5.

[8]OVISSIPOUR M, KENARI A A, MOTAMEDZADEGAN A, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of yellowfin tuna (Thunnusalbacares)[J]. Food & Bioprocess Technology, 2012, 5(2): 696-705.

[9]刘 哲. 马鲛鱼鱼肉水解物中ACE抑制肽的分离纯化及其分子结构的鉴定[D]. 海口: 海南大学, 2013.

[10]GUERARD F, GUIMAS L, BINET A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002, (19-20): 489-498.

[11]NGUYEN H T M, SYLLA K S B, RANDRIAMAHATODY Z, et al. Enzymatic hydrolysis of yellowfin tuna (Thunnusalbacares) by-products using protamex protease [J] Food Technology & Biotechnology, 2011, 49(1): 48-55.

[12]WANG X, XING R , LIU S, et al. Purification and characterization of novel antioxidant peptides of different molecular weights from mackerelPneumatophorusjaponicusprotein hydrolysate[J]. Chinese Journal of Oceanology & Limnology, 2015, 33(1): 159-168.

[13]JE J Y, QIAN Z J, LEE S H, et al. Purification and antioxidant properties of bigeye tuna (Thunnusobesus) dark muscle peptide on free radical-mediated oxidative systems[J]. Journal of Medicinal Food, 2008, 11(4): 629-637.

[14]谭洪亮, 郁 迪, 王 斌, 等. 金枪鱼鱼骨胶原肽的制备及抗氧化活性研究[J]. 水产学报, 2014, 38(1): 143-148.

[15]CHI C F, HU F Y, WANG B, et al. Influence of amino acid compositions and peptide profiles on antioxidant capacities of two protein hydrolysates from skipjack tuna (Katsuwonuspelamis) dark muscle[J]. Marine Drugs, 2015, 13(5): 2580-2601.

[16]JAO C L, WENCHING K O. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging by protein hydrolyzates from tuna cooking juice[J]. Fisheries Science, 2002, 68(2): 430-435.

[17]JUN SY, PARK PJ, JUNG WK, et al. Purification and characterization of an antioxidative peptide from enzymatic hydrolysate of yellowfin sole (Limandaaspera) frame protein[J]. European Food Research & Technology, 2004, 219(1): 20-26.

[18]HSU K C, LU G H, JAO C L. Antioxidative properties of peptides prepared from tuna cooking juice hydrolysates with orientase (Bacillussubtilis)[J]. Food Research International, 2009, 42(5-6): 647-652.

[19]HSU K C. Purification of antioxidative peptides prepared from enzymatic hydrolysates of tuna dark muscle byproduct [J]. Food Chemistry, 2010, 122(1): 42-48.

[20]KUMAR N S S, NAZEER R A, JAIGANESH R. Purification and identification of antioxidant peptides from the skin protein hydrolysate of two marine fishes, horse mackerel (Magalaspiscordyla) and croaker (Otolithesruber)[J]. Amino Acids, 2012, 42(5): 1641-1649.

[21]MATSUMURA N, FUJII M, TAKEDA Y, et al. Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bonito bowels autolysate[J] . Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 1993, 57 (5): 695-697.

[22]JUNG W K, MENDIS E, JE J Y, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from yellowfin sole (Limandaaspera) frame protein and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2006, 94(1): 26-32.

[23]QIAN Z J, JE J Y, KIM S K. Antihypertensive effect of angiotensin I converting enzyme-inhibitory peptide from hydrolysates of bigeye tuna dark muscle,Thunnusobesus[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2007, 55(21): 8398-8403.

[24]LEE S H, QIAN Z J, KIM S K. A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2010, 118(1): 96-102.

[25]张 朋, 贺卯苏, 迟长凤, 等. 金枪鱼(Katsuwonuspepelamis)碎肉蛋白降压肽的酶解制备及活性研究[J]. 海洋与湖沼, 2014, 45(5): 1092-1098.

[27]纪丽娜. 金枪鱼头酶解物免疫活性肽的分离及对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2012.

[28]王玉明, 王静凤, 薛长湖. 鲣肝脏水解物对大鼠脂肪代谢的影响[J]. 水产学报, 2009, 33(1): 146-150.

[29]ENNAASA N, HAMMAMIA R, BEAULIEUA L, et al. Purification and characterization of four antibacterial peptides from protamex hydrolysate of Atlantic mackerel (Scomberscombrus) by-products[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2015, 462(3): 195-200.

[30]WANG X, XING R, CHEN Z Y, et al. Effect and mechanism of mackerel (Pneumatophorusjaponicus) peptides for anti-fatigue[J]. Food & Function, 2014, 5(9): 2113-2119.

[31]王攀峰. 马鲛鱼加工副产物酶促水解制备铁结合肽的研究[D]. 杭州: 中国计量学院, 2014.

[32]ZHAO M, CAI M, WU F, et al. Recombinant expression, refolding, purification and characterization ofPseudomonasaeruginosaprotease IV inEscherichiacoli[J]. Protein Expression & Purification, 2016, 126(5): 69-76.

[33]HIMANSHU, SWARNKAR M K, SINGH D, et al. First complete genome sequence of a species in the genus Microterricola, an extremophilic cold active enzyme producing bacterial strain ERGS5:02 isolated from Sikkim Himalaya[J]. Journal of Biotechnology, 2016, 222: 17-18.

[34]JAMSHIDI M, GHAEDI M, DASHTIAN K, et al. Highly efficient simultaneous ultrasonic assisted adsorption of brilliant green and eosin B onto ZnS nanoparticles loaded activated carbon: artificial neural network modeling and central composite design optimization[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2016, 153: 257-267.

[35]URBISCH D, HONARVAR N, KOLLE S N, et al. Peptide reactivity associated with skin sensitization: The QSAR Toolbox and TIMES compared to the DPRA [J]. Toxicology in Vitro, 2016, 34: 194-203.

Progress in bioactive peptides obtained by enzymatic hydrolysis of Scombridae proteins

XIANG Ze-min, GE Jun-yi, QIU Xiao-ting, YAN Xiao-jun

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Scombridae fishes, as economically important marine species, are abundant sources of food proteins. Their comprehensive utilization rate, however, is still at a low level. Bioactive peptides with various biological activities such as antioxidation, anti-hypertension, immunization and antibacterial prepared by enzymatic hydrolysis is an efficient way for higher added-value of Scombridae fishes. This paper reviewed the conditions of enzymatic hydrolysis of Scombridae proteins, the approaches for purification and identification as well as the primary physiological functions of Scombridae peptides. Furthermore, the problems and corresponding countermeasures were discussed and potential applications of bioactive peptides from hydrolysates of Scombridae fishes were summarized.

Scombridae; bioactive peptides; enzymatic hydrolysis; purification; physiological functions

2016-07-15；

2016-08-02

国家自然科学基金资助项目(31400683)；浙江省自然科学基金资助项目(LQ14C050001)；宁波大学人才引进启动基金资助项目(013-E00843134702、 013-E00843144702、013-421504460)；宁波大学王宽诚基金

向泽敏，硕士，研究方向为海洋功能性多肽，E-mail: xzm1411074792@163.com

邱晓挺，博士，讲师，研究方向为生物化学与分子生物学，E-mail: xiaotingqiu@126.com

S917.4；TS254.9

A

2095-1736(2017)01-0065-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.065