有机双光子pH荧光探针研究进展

杨志广 李宁宁 张旭亮 孔辉华 郭 达 刘亚丽

(河南省周口师范学院化学化工学院 466001)

细胞内pH在生命体系许多生理过程中扮演着重要角色，包括细胞的代谢、生长、增殖、凋亡、信号转导以及离子转运等。研究发现，pH值的微小变化就有可能导致细胞功能紊乱，如引起癌症、肾衰竭、肺病、阿尔茨海默病等疾病。因此，检测细胞内pH的动态变化对于研究细胞的生理和病理过程具有十分重要的意义。荧光探针法因具有操作简便、灵敏度高、选择性好以及对细胞无损伤等特点，在检测细胞内pH变化中得到了广泛的应用。pH荧光探针主要是通过识别基团的质子化或去质子化来改变探针分子的荧光信号而实现pH响应的一类物质，大体可分为两类：一类是pH在6.80～7.40范围内灵敏响应的细胞质探针；另一类是pH在4.50～6.00范围内灵敏响应的酸性细胞器探针，如溶酶体探针。与传统的单光子荧光探针相比，双光子荧光探针具有近红外光激发、光毒性小和光漂白、自发荧光干扰弱以及组织穿透深度大等优点。特别是双光子共聚焦成像在细胞中能够延长活细胞和组织的观察时间[1～3]，这一独特优势使得双光子荧光探针技术在生物医药领域具有强大的发展潜力和广阔的应用前景。本文介绍了有机双光子吸收的基本原理以及近年有机双光子pH荧光探针的研究现状，同时对有机双光子pH荧光探针未来的发展趋势进行了展望。

1 双光子吸收基本原理

众所周知，单光子吸收一般是利用紫外或可见光激发荧光分子，只有当吸收的一个光子的能量与基态和激发态之间的能量差相匹配时才会发生。而双光子吸收是指在脉冲激光等强光激发下，在较短的时间内，经过一个中间虚拟态，介质分子同时或者先后吸收两个相同或者不同频率的光子，从基态向激发态跃迁的过程。与传统的单光子吸收线性过程相比，双光子吸收强度与激发光强度的平方成正比，是一个非线性过程。另外，双光子吸收为长波激发(700～1100 nm)短波发射，光损伤、光漂白、光毒性都较小，自发荧光干扰弱，而单光子吸收为短波激发(≤400 nm)长波发射，容易造成光损伤、光漂白和背景颜色的干扰。因此，双光子吸收在生物医学、材料、信息等多领域具有广阔的应用前景。

2 有机双光子pH荧光探针研究现状

目前文献报道的有机pH荧光探针多数为单光子荧光探针。有关双光子pH荧光探针的报道相对较少，特别能够实时成像活细胞内pH值动态变化的双光子荧光探针更少。Park等[4]设计合成了一个比率双光子pH荧光探针NP1。该探针双光子活性吸收截面大，光稳定性好，生物毒性低，能够进入活细胞，并能深入人体胃和食管组织90～180 μm处进行双光子荧光比率成像，为各种人体组织中pH的检测与非糜烂性反流病的诊断提供了强有力的帮助。Kong等[5]首次报道了基于以碳点(C-Dot)为基础的无机-有机纳米复合体系双光子pH荧光探针CD-TPY。该探针灵敏度高，选择性好，检测pH值范围宽，具有低毒性、光稳定性好、良好的生物相容性和细胞通透性，能够成功应用于活细胞生理pH值以及活组织深度达65～185 μm的双光子生物荧光成像，为未来以碳点为基础进行设计合成检测生物体内金属离子、蛋白质、DNA和其他的生物相关分析物的双光子荧光探针提供了新思路和方法。

Kim等[6]报道了一系列基于苯并咪唑衍生物检测酸性pH的双光子比率荧光探针BH(BH1-3和BH1L)。研究表明，这些探针具有细胞加载方便、毒性低、光稳定好等特点，当酸度指数(pKa)值在4.9～6.1时范围时，具有较强的双光子激发荧光，荧光颜色从蓝色向绿色转变，同时出现一个明显的等发射点，可以定量分析细胞内pH的变化。利用双光子荧光显微技术，探针BH1L还可以直接实时地观测活细胞内和活老鼠大脑组织中溶酶体隔室的pH变化情况。这些研究成果证实，BH系列探针在生物医学研究中具有重要的应用价值。

Wang等[7]设计合成了一个用于活细胞和活组织成像并能定量测量活细胞内pH的双光子比率荧光探针CBT 。该探针拥有大的双光子吸收截面、低毒性、较高的光学稳定性、良好的细胞膜穿透性和优良的生物相容性等特点，成功地实现了在HeLa细胞内H+的双光子荧光比率成像。同时该探针还可应用于大鼠肝脏活组织切片的双光子荧光显微成像，成像深度可达66 μm，为进一步的生物细胞病理研究和临床应用提供了有力的支持。

Mao等[8]设计合成了首个利用激发态分子内质子转移(ESIPT)和分子内电荷转移(ICT) 双重响应机理检测细胞内pH变化的多色双光子荧光探针BNO。研究表明，由于ESIPT效应，该探针在中性和弱碱性环境中无荧光，一旦在酸性和强碱性环境中，荧光迅速增强，同时发射不同颜色的荧光(酸性环境显示绿色，碱性环境显示青色)。此外，该探针具有pH值响应范围宽、灵敏度高、选择性好、光稳定好、探针毒性低等特点，成功实现了跟踪细胞内pH的动态变化和双光子荧光显微成像。

Sarkar等[9]以三苯基季磷盐阳离子为线粒体识别基团成功开发了一个能够定量成像活细胞和活组织线粒体内pH变化的双光子比率荧光探针CMP1。该探针具有细胞加载方便、选择性好、细胞毒性低、较强的线粒体定位能力等优点，当pH在6.0～9.0范围变化时，荧光发生从黄色到红色的颜色变化，实现了活细胞中线粒体内pH的双光子比率荧光成像。而成像结果表明细胞线粒体内pH分布存在异质性，细胞核处的线粒体内pH高于细胞外围的线粒体，该探针为在生物医学中研究线粒体内pH变化提供了一个强有力的工具。

Chen等[10]基于 A-π-D-π-A共轭体系设计合成了两个专一性检测活细胞中pH变化的双光子比率荧光探针L1和L2。探针L1和L2具有灵敏度高、荧光量子产率高、双光子吸收截面大、细胞毒性低以及生物相容性好等特点，实现了活细胞中pH变化的双光子比率荧光成像，为重要的生物过程研究提供了一种有效的工具。

Dong等[11]首次报道了一个标记肿瘤细胞中溶酶体pH变化的双光子荧光探针BN-lys。该探针在正常细胞中荧光较弱，而对肿瘤细胞中溶酶体pH表现出了较强的单-双光子荧光响应活性，具有灵敏度高、响应速度快、生物毒性低、优异的光稳定性和可逆性等特点，实现了肿瘤细胞中溶酶体pH变化的双光子荧光成像，有望在生物研究中具有重要的实际应用价值。

3 展望

综上所述，目前有机单光子pH荧光探针已有很多报道，而双光子pH荧光探针报道相对较少，虽然取得了一定的发展，但仍存在一些问题，主要表现为以下几个方面：①进一步探索合成双光子pH荧光探针的新方法和种类，寻找大双光子吸收截面、高荧光量子产率及大Stokes位移的有机双光子pH荧光探针具有重要的研究意义；②开发生物透膜性好、生物相溶性好、能够对活细胞和深层组织成像(尤其对细胞器内pH变化)的有机双光子pH荧光探针是人们未来的一个研究重点；③发展毒性很低甚至无毒，实现多种活体细胞内比率荧光成像的双光子pH荧光探针是一个重要的发展方向。总之，有机双光子pH荧光探针在生物、化学和临床医学等方面具有潜在的应用价值。