人参茎叶提取物及配伍石菖蒲挥发油的大鼠在体肠吸收动力学的研究

郑梦成+杜守颖+贾山+马军明+张晴+白洁+陆洋

[摘要]该试验通过研究复方金思维方中君药人参茎叶提取物配伍使药石菖蒲挥发油后有效成分人参皂苷 Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd肠吸收的变化，验证该方中佐药石菖蒲能否协助君药人参茎叶总皂苷加强其疗效。试验采用大鼠在体单向肠吸收模型考察3种皂苷成分及配伍石菖蒲挥发油后的肠吸收情况，以高效液相色谱法测定灌流液中人参皂苷 Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的质量浓度，计算其肠吸收动力学参数；人参茎叶提取物中人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd在小肠上段吸收速率较大；药物浓度对其吸收速率没有显著性影响，提示吸收机制为被动扩散；石菖蒲挥发油对其在小肠的吸收有显著促进作用，说明方中人参皂苷提取物与石菖蒲的配伍科学合理。

[关键词]人参茎叶提取物； 石菖蒲； 在体单向肠吸收

[Abstract]To investigate the changes in intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re and ginsenosides Rd after combined administration of Ginseng Radix et Rhizoma extract and Acori Tatarinowii Rhizoma， in order to confirm whether the combined administration is scientific and rational， and provide experimental basis for pharmaceutical studies of the formula. Anin vivosingle-pass perfusion method was performed to study the effect of various concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd on the intestinal absorption at duodenum， jejunum， ileum and colon. The concentrations of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were determined by RP-HPLC.The absorption rate constant （Ka） and the apparent absorption coefficient（Papp） of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were calculated.The result showed that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd had a high absorption rate on upper portion of the small intestine. The drug concentration had not significantly impact on the absorption rate， suggesting that ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd were absorbed via passive diffusion.Volatile oil of Acori Tatarinowii Rhizoma had obvious effect in enhancing intestinal absorption of ginsenosides Rg1， ginsenosides Re， ginsenosides Rd， indicating that the combined administration of Ginseng extract and Acorus tatarinowii Schott is scientific and rational.

[Key words]extracts of Ginseng Radix et Rhizoma； Acori Tatarinowii Rhizoma；in vivosingle-pass perfusion method

doi：10.4268/cjcmm20162124

中醫方剂中有使用“药引子”的历史，即在君臣配伍时添加使药作为“药引”起到“引药上行”“助药效”之作用，而芳香类中药因其辛香走窜之性多作为使药应用到临床组方中，如冰片、石菖蒲等。复方金思维来源于临床经验方，主要以人参茎叶提取物配伍石菖蒲治疗老年痴呆症。人参茎叶具有大补元气、安神益智^[1]之功效，为方中君药。人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd是人参的主要活性成分，现代研究表明其具有改善记忆功能^[2]、抗肿瘤抗衰老^[3-4]、抗菌抗病毒^[5]、促进细胞增殖^[6]等作用。其肠道吸收受其自身性质、胃肠道酸性环境、场内菌群、肝脏首过效应等多重因素的影响，口服生物利用度很低^[7-10]。石菖蒲为方中使药，具有芳香开窍、引药上行的作用，挥发油是其有效成分。现代研究表明其在治疗阿尔茨海默病方面具有确切疗效^[11-12]，对脑自由基损伤有保护作用，并提高血脑屏障通透性。人参茎叶提取物配伍石菖蒲后能否改善有效成分的肠吸收情况，是处方设计的重要依据。

课题组前期对复方金思维的药效学研究，确定了最佳提取工艺，并根据临床给药的需要制成颗粒剂。对于口服给药剂型来说，药物的肠吸收特性能直接反应口服后的吸收效果。因此本文拟根据处方配比，采用大鼠在体肠吸收模型研究人参茎叶提取物及配伍石菖蒲后有效成分的吸收动力学特征探讨人参茎叶提取物中人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的吸收机制及配伍石菖蒲后的肠吸收变化情况，旨在为复方金思维的制剂研制提供生物药剂学依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪；DDB-300电子蠕动泵（上海之信仪器有限公司）；TGL-16G飞鸽离心机（上海安亭科学仪器厂）；VORTEX-5旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；赛多利斯 BSA 224S型电子分析天平（北京赛多利斯公司）。

人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院，批号110703-201430）；人参皂苷Re对照品（中国食品药品检定研究院，批号110754-201425）；人参皂苷Rd对照品（中国食品药品检定研究院，批号111818-201302）；人参茎叶提取物（南京泽朗医药科技有限公司）；石菖蒲挥发油（处方量石菖蒲经水蒸气蒸馏，至油量不再增加）；乙腈（Sigma，色谱纯），甲醇（Sigma，色谱纯），娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

SD大鼠，雄性，220～240 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 试液配制

2.1.1 Krebs-Ringers营养液的配制 参考文献[13]配制Krebs-Ringers营养液。

2.1.2 肠循环液的配制 灌流液A：分别精密称取人参茎叶提取物125，250，500 mg于250 mL量瓶中，K氏液溶解并稀释至刻度，作为低、中、高浓度的药物肠灌流液。

灌流液B：精密称取人参茎叶提取物250 mg于250 mL量瓶中，另取50 μL石菖蒲挥发油，用50 μL乙醇溶解后加入量瓶中，K氏液溶解并稀释至刻度，作为石菖蒲挥发油配伍中浓度人参茎叶提取物的肠灌流液。

2.1.3 对照品储备液的配制 精密称取人参皂苷Rg1 10 mg，人参皂苷Re 15 mg，人参皂苷Rd 10 mg，置25 mL量瓶中，用K氏液溶解并稀释至刻度，摇匀，得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd对照品储备液。

2.2 灌流液样品处理方法

吸取灌流液1 mL，加入甲醇3 mL沉淀蛋白，吸取上清液，氮气吹干，1 mL甲醇复溶，经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

2.3 腸灌流液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的含量测定

2.3.1 色谱条件 CAPCELL PAK C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～28 min，20% A，28～58 min，20%～39% A，58～60 min，39% A；检测波长203 nm；柱温30 ℃；流速1.5 mL·min^-1。对照品溶液及灌流供试品溶液的色谱图见图1。

2.3.2 标准曲线的制备 分别精密量取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rd对照品储备液0.5，1，2，4，6，8 mL于10 mL量瓶中，用空白肠灌流液稀释并定容至刻度，分别得到一系列质量浓度的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及人参皂苷Rd对照品溶液，按2.2项下方法处理，测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），进行线性回归。人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的回归方程分别为Y=1.338 2X-2.030 3，r=0.999 9；Y=1.390 3X-2.706 9，r=0.999 9；Y=1.92X-4.720 1，r=0.999 9。表明人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd分别在20.26～405.20，25.02～500.40，20.26～405.20 mg·L^-1与峰面积线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 分别精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd对照品适量，用空白肠灌流液稀释至不同倍数，得低、中、高（人参皂苷Rg1依次为81.04，162.08，324.16 mg·L^-1，人参皂苷Re依次为100.08，200.16，400.32 mg·L^-1，人参皂苷Rd依次为81.04，162.08，324.16 mg·L^-1）3个质量浓度的对照品溶液，按2.2项下方法处理，每个浓度重复进样3次，低浓度组人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的RSD分别为1.4%，1.2%，0.40%，中浓度组RSD分别为1.5%，2.0%，1.1%，高浓度组RSD分别为0.40%，0.50%，0.80%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 回收率试验 取大鼠空白肠液1 mL，分别加入1 mL低、中、高浓度的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd对照品溶液，按2.2项下方法处理分析测定，计算回收率，低浓度组人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd分别为96.61%，97.26%，96.38%，中浓度组分别为98.22%，98.68%，97.91%，高浓度组分别为96.37%，96.48%，96.78%，RSD均小于5.0%，符合药动学试验要求。

2.4 人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd在空白肠灌流液中的稳定性研究

用空白肠灌流液配制 1.0 g·L^-1的人参茎叶提取物溶液3 份，37 ℃水浴孵育4 h，分别于0，0.5，1，2，3，4 h取样，按2.2项下方法处理，分析比较不同时间的浓度变化。结果在37 ℃水浴中放置4 h，样品中人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的RSD分别为1.1%，1.3%，1.5%，灌流液样品基本稳定（RSD<3.0%）。

2.5 蠕动泵管路的物理吸附情况考察

以灌流液A，37 ℃水浴恒温，于体外空循环3 h，在0，0.25，0.5，1，2，3 h取样测定，考察人参Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd在蠕动泵管路的吸附情况。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的RSD分别为0.50%，0.20%，1.7%，说明管路对样品中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd没有吸附（RSD<3.0%）。

2.6 大鼠在体单向肠灌流试验

大鼠手术^[14]后，以37 ℃预热的生理盐水以1 mL·min^-1冲净肠内容物，排净生理盐水，用预热37 ℃的灌流液以0.2 mL·min^-1灌流30 min平衡，收集流出液并开始计时，于15，30，45，60，75 min收集灌流液，并精确称量流出液质量。试验结束后，参考文献方法^[14]测量肠段长度及内径。

2.7 吸收动力学参数的计算

参考文献[14]采用重量法计算药物吸收速率常数Ka和表观吸收系数Papp。

2.8 统计方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），当P<0.05时判定具有显著性差异。

3 结果

用SPSS 17.0软件对数据进行ANOVA检验，结果表明在0.5～2.0 g·mL^-1，药物质量浓度对人参茎叶提取物中人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd在小肠的吸收速率没有显著性影响，吸收机制为被动扩散。人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd在各肠段的吸收速率常数大小：十二指肠≈结肠>空肠≈回肠，表明其在小肠上端吸收较好。配伍石菖蒲挥发油后，可使人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的Ka分别增加7.8，6.3，3.8倍，表明石菖蒲挥发油对其小肠吸收有明显的促吸收效果，见表1～4。

4 讨论

复方金思维是中医临床经验方，治疗老年痴呆症疗效显著。人参茎叶提取物为方中君药，石菖蒲为使药。配伍石菖蒲后能否改善方中主要有效成分人参茎叶皂苷的肠道吸收是本研究的主要内容。

本试验首先采用大鼠在体单向肠灌流模型对人参茎叶提取物单味组吸收动力学特征进行了初步探究，证实人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd的肠内吸收机制为被动扩散，提示可将含人参皂苷Rg1，Re，Rd的药物设计成药物缓释系统，且在小肠上端吸收较好的成分可以通过靶向给药技术（如漂浮、黏附滞留技术等）提高制剂的生物利用度。

人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd是君药人参茎叶的主要成分，石菖蒲挥发油是方中使药石菖蒲的主要成分，文献报道，中药挥发性成分对相伍成分的吸收及生物利用度存在不同程度的影响^[15]，多有促透剂的作用，能促进其他药物成分的吸收^[16]。本试验利用大鼠在体肠灌流模型考察配伍石菖蒲后人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rd在小肠不同肠段的吸收情况，试验结果显示，石菖蒲对人参皂苷Rg1，Re，Rd的小肠吸收具有明显的促进作用，这符合文献结果的推断，也验证了复方金思维配伍的合理性。究其作用机制，动物实验证明^[17]芳香开窍药不仅自身具有良好的细胞通透性，还能促进其他药物在某些器官组织的细胞通透性。另外，胡園等^[18]证实了石菖蒲作为使药可“醒脑开窍”的药理作用，其作用机制是使内皮细胞间的紧密连接松弛，导致血脑屏障通透性增加，因而可以提高脑组织中配伍药物的含量。该研究提示石菖蒲促进人参皂苷在肠道的吸收机制也可能与此类似，石菖蒲可能通过调节胃肠道多肽激素或紧密连接蛋白，使胃肠壁细胞间紧密连接松弛，通透性增加，从而促进药物胃肠道运动、透过和吸收。本文只对石菖蒲挥发油对人参皂苷Rg1，Re，Rd的促肠道吸收作用做了初步探讨，其确切的作用机制还有待进一步研究的推进。

同时，本试验结果表明，石菖蒲挥发油对于3种皂苷成分促吸收作用的程度不同，具体表现为对于人参皂苷Rg1，Re（人参三醇型）促吸作用较人参皂苷Rd（人参二醇型）稍大，推测可能与其母核结构有关，也与其代谢后产物的种类与性质有关。皂苷类成分在体内并不是完全以原形吸收，必然受到酸碱环境，胃肠道菌群，肝脏代谢的影响而发生一系列降解和变化^[7-10]，而关于石菖蒲挥发油的促吸收作用在3种皂苷成分中显示出差异的原因，还有待进一步的深入研究。

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[责任编辑 曹阳阳]