Illumina高通量测序技术分析中周羌稞养生酒窖泥细菌多样性

覃荣周，王琪林,2，任朝琴,3，戴先芝,3，刘 通，曾权高

（1.阿坝师范学院藏羌医药研究所，四川阿坝藏族羌族自治州623001；2.成都体育学院运动医学与健康研究所，四川成都610041；3.阿坝师范学院化学化工与生命科学系，四川阿坝藏族羌族自治州623001；4.四川省阿坝州中周酒业有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州624000）

Illumina高通量测序技术分析中周羌稞养生酒窖泥细菌多样性

覃荣周1，王琪林1,2，任朝琴1,3，戴先芝1,3，刘 通1，曾权高4

（1.阿坝师范学院藏羌医药研究所，四川阿坝藏族羌族自治州623001；2.成都体育学院运动医学与健康研究所，四川成都610041；3.阿坝师范学院化学化工与生命科学系，四川阿坝藏族羌族自治州623001；4.四川省阿坝州中周酒业有限公司，四川阿坝藏族羌族自治州624000）

以不同窖龄（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞养生酒窖泥为研究对象，利用Illumina高通量测序技术对窖泥细菌16S rRNA V4～V5区进行测序，分析其细菌多样性。结果表明，窖泥中细菌多样性（Shannon指数）和丰富度（Chao指数）随着窖龄的增加而显著提高（P＜0.05）。不同窖龄窖泥的细菌群落组成存在差异，盐扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae），瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）和梭菌属（Clostridium）为不同窖龄窖泥的共有细菌；类芽孢杆菌属（Paemibacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）和链球菌属（Streptococcus）只出现在30年窖龄窖泥中；PCA结果分析表明，相同窖龄窖泥中的细菌具有更高的相似性，说明窖龄是影响窖泥细菌群落组成的重要因素之一。

中周羌稞养生酒；浓香型；窖泥；细菌多样性；Illumina高通量测序技术

白酒是我国特有的一种由粮食发酵而来的蒸馏酒，其中以浓香型白酒的产量最多，占白酒总量的70%左右[1-2]。中周羌稞养生酒是四川阿坝地区著名的浓香型白酒之一，生产过程中以中高温大曲配合窖泥发酵，由于其原料为青稞而呈现出其特有的风味，并深受当地人民的喜爱[3]。窖泥经过不同时间的演化具有其独特的微生物特性[4]，因此，对中周羌稞养生酒不同窖龄的窖泥进行微生物多样性的研究有助于揭示窖泥的演变过程。

传统的培养方法只能对窖泥中少数的微生物进行鉴定，研究表明，窖泥中不易培养或者不能培养的微生物（如厌氧或者兼性厌氧微生物）在浓香型白酒生产中也发挥了重要的作用[5-6]。目前，变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是微生物多样性研究中最常用的方法之一，它能够对环境中不能培养的微生物进行鉴定，但是此技术并不能用于定量，且通量小，只能鉴定环境中的少部分微生物[7-8]。Illumina高通量测序技术是近年来兴起的分析微生物多样性的技术，具有一定的优越性，可准确的对环境中的微生物进行定量，且具有较高的通量，能够较为全面的揭示环境中微生物的特性[9-10]。因此，本研究利用Illumina高通量测序技术对窖龄为5年、10年、20年和30年的中周羌稞养生酒窖泥进行细菌的多样性分析，以期揭示不同窖龄中周羌稞养生酒窖泥微生物的多样性，为优质浓香型白酒的生长提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 窖泥样品

本试验中的窖泥均为阿坝中周羌稞养生酒优质窖泥，采自四川省阿坝州中周酒业有限公司，窖龄分别为5年、10年、20年和30年。每个窖龄的窖泥分别采自5口窖池，分别编号为5年（1、2）、10年（3、4）、20年（5、6）、30年（7、8）。取样方法为从每个窖龄窖池的上层、中层和底部分别取样，混合均匀后于-20℃保藏待用[11]。

1.1.2 主要试剂

土壤DNA提取试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）纯化试剂盒、DNA Marker D2000：北京天根生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：郑州中天实验仪器有限公司；琼脂糖（分析纯）：北京沃比森科技有限公司。细菌16S rRNA V4～V5区引物515F和907R 149：北京诺禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL-16M台式高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；PL203型电子分析天平：唐山蓝箭电子衡器有限公司；DZKW-S-8恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；DYY-10C型电泳仪：北京市六一仪器厂；illumina Miseq PE250高通量测序仪：上海美吉生物医药科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥细菌DNA提取及PCR扩增

根据邓杰等[12]的报道采利用DNA提取试剂盒（MIBIO UltraClean Soil DNA Isolation Kit）对不同窖龄的窖泥细菌DNA进行提取。以不同窖龄窖泥细菌总DNA为模板，引物采用细菌16S rRNA V4～V5区引物515F（5′-148-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′）和907R 149（5′-CCGTCAAATTCMT TTRAGTTT-3′）[13]进行TouchDownPCR扩增，TouchDown PCR反应条件参考TIAN W等[14]的方法。

1.3.2 PCR产物纯化

利用PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化，之后利用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR纯化产物进行检测，并在紫外凝胶成像系统中观察条带，利用分光光度计检测DNA扩增产物在波长230 nm、260 nm和280 nm处的吸光度值，并计算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，确定扩增产物的浓度和纯度，满足纯度要求后用于后续试验。

1.3.3 Illumina高通量测序

利用Illumina高通量测序仪对窖泥细菌DNA PCR扩增产物进行测序分析，为了确保实验数据的准确性及普遍性，需对获得的原始序列进行适当的筛选，去掉低质量的序列，进而获得满足后续分析要求的高质量序列。通过与核糖体数据库（ribosomal database project，RDP）已知序列的比对，修剪适配器和核糖体标签来减少测序错误率[15]。利用Mothur软件识别和消除嵌合体来改善序列质量。

1.3.4 生物信息学分析

利用微生物生态学的定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）平台对窖泥细菌DNA序列进行高级生物信息分析，每个样品剩余的高质量序列用于划分操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。在97%相似度的OTUs进行同源性比对的基础上，评估窖泥样品细菌的丰富度（Chao指数）和多样性（Shannon指数）[16]。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）用来反映不同窖泥样本之间细菌组成的差异。

1.3.5 数据分析

实验结果以平均数±标准偏差表示，并利用SPSS17.0软件对实验数据进行分析，选择Tukey's检验，当P＜0.05时可视为具有统计学意义，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 窖泥样品DNA扩增产物质量检验

图1 窖泥样品PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of pit mud samples

表1 窖泥样品PCR产物检测结果Table 1 Detection results of PCR amplification products of pit mud samples

由图1可知，窖泥样品PCR扩增产物条带清晰单一，不存在拖带或者引物二聚体，条带大小在500 bp左右，符合16S rRNA V4～V5区扩增产物要求。同时由表1可知，8个窖泥样品DNA扩增产物的OD260nm/OD280nm值都在1.8～2.0之间，OD230nm/OD260nm值都＞2.0，说明PCR产物的浓度和纯度都较高，可以满足Illumina高通量测序分析的要求。

2.2 测序数据的合理性分析

为了进一步分析测序数据的合理性，对窖泥样品进行稀疏曲线分析，以样本中随机抽取测序序列数为横坐标，OTU数为纵坐标，绘制出稀疏曲线，结果如图2所示，图中稀疏度是一定测序数量中所测出的OTU数量的多少，是通过高通量测16s RNA相关序列，比对序列的同源性，由软件分析得到。由图2可知，随着测序数量增加，各窖泥样品的稀疏曲线先经过陡坡期，然后趋于平坦，说明继续增加测序的数量对产生的OTU数量的影响较少，样品的测序条数能够满足试验的后续要求，可以用于进一步的样品细菌多样性分析。

图2 窖泥样品的稀疏曲线分析Fig.2 Rarefaction curves analysis of pit mud samples

2.3 不同窖龄窖泥中细菌丰富度和多样性分析

表2 不同窖龄窖泥样品细菌多样性和丰富度比较Table 2 Comparison of bacterial diversity and abundance of pit mud with different cellar ages

由表2可知，8个样品共有548 313条序列，进行抽平（subsample）后，计算alpha多样性和beta多样性，经过深度抽平处理后，每个样品最后的序列为19 353条，此序列的数量能够覆盖整个样品序列的98%以上，这说明得到的样品序列质量较高，能够用于窖泥中细菌多样性的研究。在97%相似度水平下，所有窖泥样品序列总共被归类为7 925个OTUs。其中5年、10年、20年和30年窖泥中细菌的OTUs分别为254±5.41、321±13.11、452±13.23和558±17.59，随着窖泥窖龄的增加，样品中OTUs的数量显著增加（P＜0.05）。

通过对不同窖龄窖泥样品细菌多样性（Shannon指数）和丰富度（Chao指数）分析可知，所有窖泥样本中细菌的多样性和丰富度都较高，这说明窖泥中的细菌群落特征较为复杂。此外，Shannon指数和Chao指数都随着窖泥窖龄的增加而显著增加（P＜0.05）。

2.4 不同窖龄窖泥中细菌种群结构分析

利用Illumina Miseq高通量测序技术对窖泥细菌DNA PCR产物进行测序分析，通过数据库比对得到窖泥细菌的种类，并进一步计算各种细菌所占细菌总数的比例（即相对含量），结果如图3所示。

图3 不同窖龄窖泥中细菌群落结构分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

8个样品中的细菌共包含7个门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、互养菌门（Synergistaceae）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）和黏胶球形菌门（Lentisphaerae），其中厚壁菌门，互养菌门和绿弯菌门为优势菌门，占细菌总数的90.22%。此外，其他相对含量小于0.01%的所有属的总和用“Others”表示。随着窖龄的增加，窖泥中“Others”的比例也随之增加，这也表明了窖泥中细菌的多样性随着窖龄的增加而增加。

由图3可知，具有相同窖龄的窖泥中细菌构成较为相似，不同窖龄窖泥之间的群落构成存在一定的差异。5年窖龄的窖泥中优势的细菌为：梭菌属（Clostridium）（26.32± 1.92）%、盐扁菌科（Haloplasmataceae）（16.72±1.72）%、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）（10.31±0.82）%、互养菌科（Synergistaceae）（9.31±0.32）%和瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）（9.02±0.18）%；10年窖龄的窖泥中优势的细菌为：梭菌属（Clostridium）（20.15±1.36）%、盐扁菌科（Haloplasmataceae）（12.35±0.92）%、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）（10.07±1.12）%、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）（7.22± 1.21）%、互养菌科（Synergistaceae）（7.12±0.81）%、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）（7.12±0.48）%和类芽孢杆菌属（Paemibacillus）（6.56±0.37）%；20年窖龄的窖泥中优势的细菌为：梭菌属（Clostridium）（20.43±1.09）%、盐扁菌科（Haloplasmataceae）（13.47±0.76）%、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）（8.88±0.81）%、喜热菌属（Caloramator）（7.66± 0.83）%、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）（7.12±0.63）%、类芽孢杆菌属（Paemibacillus）（6.92±0.84）%、假单胞菌科（Pseudomonadaceae，5.81±0.64%）、互养菌科（Synergistaceae）（5.32±0.83）%和芽孢杆菌（Bacillus）（1.01±0.03）%；30年窖龄的窖泥中优势的细菌为：梭菌属（Clostridium）（14.98± 0.84）%、盐扁菌科（Haloplasmataceae）（9.35±0.73）%、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）（6.05±0.73）%、类芽孢杆菌属（Paemibacillus）（5.99±0.44）%、喜热菌属（Caloramator）（5.91± 0.76）%、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）（5.63±0.36）%、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）（3.16±0.21）%、互养菌科（Synergistaceae）（2.89±0.23）%、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）（2.44±0.16）%、链球菌属（Streptococcus）（2.11±0.16）%和消化球菌科（Peptococcaceae）（2.01±0.17）%。可见随着窖龄的增加，窖泥中细菌的群落结构也发生了变化。而通过不同窖龄窖泥优势细菌的比较可知厚壁菌门中的盐扁菌科、乳酸杆菌，瘤胃球菌属和梭菌属为不同窖龄窖泥的共有细菌，而类芽孢杆、芽孢杆菌属、消化球菌科、喜盐芽孢杆菌属和链球菌属等可能在高窖龄（30年）中周羌稞养生酒的发酵中发挥重要的作用。

2.5 PCA分析

图4 不同窖龄窖泥细菌群落结构PCA分析Fig.4 PCA analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

图4 为不同窖龄窖泥细菌群落结果的PCA分析图，由图4可知，8个窖泥样品共分为了4个组，不同窖龄的4个窖泥样品聚成一组，分别为A（1和2号样品）、B（3和4号样品）、C（5和6号样品）和D（7和8号样品），这显示具有相同窖龄的窖泥中具有相似的细菌群落结构，而不同窖龄的窖泥中细菌的群落结果则为分散和远离现象，说明群落之间有明显的差异。表明窖泥中细菌群落的组成与窖泥的窖龄密切相关。

3 结论

利用Illumina高通量测序技术能够较为全面的分析中周羌稞养生酒不同窖龄窖泥中细菌的多样性。窖泥中细菌的生物多样性和丰富度随着窖泥窖龄的增加而显著增加。细菌的组成也发生了改变，其中盐扁菌科、乳酸杆菌、瘤胃球菌属和梭菌属为4种窖龄窖泥的共有细菌，而类芽孢杆、芽孢杆菌属、消化杆菌科、喜盐芽孢杆菌属和链球菌属只出现在高窖龄中周羌稞养生酒窖泥中，PCA分析进一步表明中周羌稞养生酒窖泥中细菌群落的组成与窖泥的窖龄密切相关。

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Analysis of bacterial diversity in pit mud of Zhong-Zhou highland barley health liquor by Illumina high-throughput sequencing

QIN Rongzhou1,WANG Qilin1,2,REN Chaoqin1,3,DAI Xianzhi1,3,LIU Tong1,ZENG Quangao4(1.Tibetan-Qiang's Medicine Research Institute,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001, China;2.Sports Medicine and Health Research Institute,Chengdu Sports University,Chengdu 610041,China;3.Department of Chemical Engineering and Life Science,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001,China; 4.Zhong-Zhou Highland Barley Wine Industry Co.,Ltd.,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 624000,China)

Using pit mudfrom different cellars with the ages(5 years,10 years,20 years and 30 years)of Zhong-Zhou highland barley health liquor as the research objects,16S rRNA V4-V5 sequence of bacteria in the pit mud was detected by Illumina high-throughput sequencing,and the diversity of bacteria was analyzed.The results showed that the diversity(Shannon index)and abundance(Chao index)of bacteria in pit mud with increasing of cellar age were increased significantly(P＜0.05).The bacterial community composition of pit mud with different cellar ages had difference.Haloplasmataceae,Lactobacillaceae,RuminococcceaeandClostridiumwere the common bacteria of pit mud with different cellar ages.Paemibacillus,Bacillus,Peptococcaceae,HaloballusandStreptococcusonly appeared in the pit mud with 30 years cellar age.PCA analysis indicated that the bacteria in the pit mud with the same cellar ages had a higher similarity,which showed that cellar age was one of the important factors that affected the bacterial community of pit mud.

Zhong-Zhou highland barley health liquor;Luzhou-flavor;pit mud;bacterial diversity;Illumina high-throughput sequencing

TS255

0254-5071（2017）01-0138-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.029

2016-07-05

四川省哲学社会科学重点研究基地2014年度课题(QXJ1401)；阿坝师范学院2014专项基金课题(JY14-02)；四川省羌学学会藏羌地区医药研究所2015年度资助项目(LYH15-01)

覃荣周(1977-)，男，副教授，硕士，研究方向为民族传统医学与公共卫生。