稀酸预处理玉米芯酶解工艺响应面优化研究

杨盛茹，邹 建，丁长河*，刘洪斌，张 煌

（1.河南牧业经济学院食品工程学院，河南郑州450046；2.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；3.中国动物疫病预防控制中心，北京100125）

稀酸预处理玉米芯酶解工艺响应面优化研究

杨盛茹1，邹 建1，丁长河2*，刘洪斌3，张 煌1

（1.河南牧业经济学院食品工程学院，河南郑州450046；2.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001；3.中国动物疫病预防控制中心，北京100125）

木质纤维原料还原糖（葡萄糖、木糖）转化是燃料乙醇生产的关键步骤之一，该文以玉米芯为原料，采用稀硫酸处理、酶水解以提高还原糖转化量。以还原糖转化量为考核指标，采用单因素试验及响应面试验设计优化稀酸处理玉米芯酶解条件，拟合硫酸体积分数、加酶量、酶解时间3个因素对还原糖转化量的回归模型。结果表明，最佳酶解工艺为121℃条件下预处理60 min，硫酸体积分数0.8%，料液比1∶15（g∶mL），加酶量7%（纤维素酶∶半纤维素酶1∶1），酶解时间70.9 h。在此最佳条件下，采用高效液相色谱（HPLC）法测定酶解液中还原糖转化量为462.62 mg/g，其中木糖、葡萄糖转化量分别为330.02 mg/g、132.60 mg/g，还原糖转化率可达46.3%。

玉米芯；稀酸预处理；酶解；响应面试验；高效液相色谱

能源、环境危机是21世纪制约人类社会、经济可持续发展的主要瓶颈。当前，燃料乙醇是除生物柴油外规模化使用的生物能源品[1]。木质纤维生物质是当前生产生物燃料乙醇的重要原料，其资源广泛且价格低廉[2-3]。

我国的玉米播种面积位居世界第二[4]，据国家统计局发布的公告显示，2015年我国玉米播种面积381.166 km2，总产量22 458.0万t[5]，而玉米芯产量据估算可达约7 487.04万t[6-7]。有专家学者研究以玉米芯为原料制备还原糖，但是转化率有待提高，如罗鹏等[8-9]研究用超临界二氧化碳及超声预处理后再用稀酸水解，得出还原糖产率为39.5%；SIDIRAS D等[10]以硫酸作为催化剂在140℃条件下进行有机溶剂处理，得到质量分数为27%的可溶性糖。

木质纤维原料生产乙醇要经过预处理、酶解糖化、发酵等过程，其中高效的预处理是燃料乙醇生产的一个关键环节，稀酸法由于水解浓度低、应用过程较简单、适用于规模化大生产，一直备受关注[11-14]。利用酶水解产生的还原性糖，具有糖产率高、副产物少等特性，但是酶解过程本身复杂，且影响因素较多，只有在合适的条件下才能发挥出最佳活性[15]。响应面法在筛选培养基及优化等方面应用较多[16]，但在优化预处理、酶解过程中应用较少。

本研究以玉米芯为原料，用稀硫酸预处理、纤维素酶和半纤维素酶水解，并用单因素及响应曲面试验对还原糖（葡萄糖、木糖）转化工艺条件进行优化。对于木质纤维原料转化为可发酵性还原糖的测定方法有多种，其中高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法快捷方便、准确性高，因此试验中选用此法进行还原糖定量分析[17]。本研究旨在探索高效转化玉米芯还原糖的工艺，为玉米芯的有效利用提供科学依据，进而为生物转化玉米芯制取乙醇的工业化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米芯（郑州市上街区），自然晾晒干燥，粉碎过筛（直径4 mm）后保存；硫酸、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司；纤维素酶和半纤维素酶（酶活均为10 000 U/g）：肇东日程酶制剂有限公司；木糖、葡萄糖（均为色谱纯）：上海锐谷生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters2695高效液相色谱：美国Waters公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；YX280B手提式不锈钢蒸汽锅：上海三申医疗器械有限公司；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 还原糖含量测定

采用高效液相色谱法测定还原糖含量。色谱条件为：Waters Carbohydrate High Performance色谱柱（4.6 mm× 250mm,4μm）；流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量10μL；流动相乙腈:水（75:25,V/V）；氮气压力25psi；检测器温度80℃。

木质纤维原料经处理后转化为可发酵性的还原糖主要是木糖、葡萄糖[18]，分别以葡萄糖、木糖为标准品，二者的保留时间分别为8.406 min、6.280 min，分别以葡萄糖、木糖质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制葡萄糖、木糖标准曲线，分别得葡萄糖标准曲线回归方程为：y＝3×106x-2×106，相关系数为R2＝0.993；木糖标准曲线回归方程为：y＝2×106x-3×106，相关系数为R2＝0.998。利用葡萄糖、木糖标准曲线回归方程计算样品中还原糖含量，还原糖转化量计算公式如下：

式中：YRS为还原糖转化量，mg/g；CRS为还原糖含量，mg/L；V为样品体积，L；m为玉米芯质量，g。

还原糖转化率即玉米芯中还原糖的转化比率，其计算公式为：

1.3.2 玉米芯酶解条件优化单因素试验

玉米芯4.00 g，加入一定硫酸溶液60 mL，混合均匀后于90℃浸泡4 h，于121℃预处理一定时间后加入酶[纤维素酶∶半纤维素酶（1∶1）]（调pH为4.5），在130 r/min、45℃条件下水解一定时间后以5 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm膜过滤后于4℃保存用于HPLC分析。以还原糖转化量为评价指标，考察不同硫酸体积分数（0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、不同料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21（g∶mL））、不同预处理时间（0、15 min、30 min、45 min、60min、75min）、不同酶解时间（0、24h、36h、48h、60h、72h、84 h），不同加酶量（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）对玉米芯酶解效果的影响。

1.3.3 响应面法优化玉米芯酶解条件

根据单因素试验结果，采用响应面软件Design Expert 7.0对玉米芯酸法预处理、酶解条件进行3因素3水平的中心组合设计（central composite design，CDD），以还原糖转化量（Y）作为响应值对工艺参数进行优化。CDD试验的因素与水平见表1。

表1 CCD试验因素与水平Table 1 Factors and levels of CCD experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 硫酸体积分数对玉米芯还原糖转化量影响

图1 硫酸体积分数对木糖(a)及葡萄糖(b)转化量的影响Fig.1 Effect of acid concentration on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由图1可知，经稀硫酸处理后酶解液中木糖转化量远高于葡萄糖，同时分析得出硫酸体积分数逐渐增大，还原糖（木糖、葡萄糖）转化量曲线类似于抛物线即先增加后减少，这是因为在处理时硫酸体积分数过小无法充分破坏玉米芯纤维结构致使降解不彻底，而过大时转化的还原糖由于进一步降解而减少。在硫酸体积分数为0.8%时木糖、葡萄糖转化量均达到最大，分别为303.28 mg/g和117.04 mg/g。因此，确定硫酸体积分数为0.8%。

2.1.2 预处理时间对还原糖转化量影响

图2 预处理时间对木糖(a)及葡萄糖(b)转化量的影响Fig.2 Effect of pretreatment time on the conversion amount of xylose(a)and glucose(b)

由图2可知，在试验0～60 min范围时，随着预处理时间延长，葡萄糖转化量和木糖转化量均增加，且预处理时间为60 min时，木糖转化量最大为289.56 mg/g，而葡萄糖转化量在预处理时间＞60 min之后略有增加。综合酶解液中还原糖转化量及时间成本，选择预处理时间为60 min。

2.1.3 料液比对还原糖转化量影响

由图3可知，料液比在1∶9～1∶21（g∶mL）时，酶解液中木糖、葡萄糖的转化量均随料液比的变化而呈现先增加后减少的趋势；木糖转化量在料液比1∶15（g∶mL）时最大为289.56 mg/g，葡萄糖转化量在料液比1∶18（g:mL）时最大为109.52 mg/g。综合考虑酶解液中还原糖转化量，确定料液比为1∶15（g∶mL）。

图3 料液比对木糖(a)及葡萄糖(b)转化量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

2.1.4 加酶量对还原糖转化量影响

图4 加酶量对木糖(a)及葡萄糖(b)转化量的影响Fig.4 Effect of enzyme addition on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由图4可知，在没有纤维酶类的条件下水解仍检测出木糖和葡萄糖，说明稀酸的浸泡、高温作用等这些过程已经有还原糖转化，还原糖转化量为235.56 mg/g（木糖和葡萄糖转化量分别是124.56 mg/g、34.25 mg/g）；加酶量1%～6%时，随加酶量的增加，酶解液中木糖和葡萄糖转化量均逐渐增大，且变化较明显；在加酶量＞6%时，木糖、葡萄糖转化量增加逐渐平缓。综合成本确定加酶量为6%。

2.1.5 酶解时间对还原糖转化量影响

图5 酶解时间对木糖(a)及葡萄糖(b)转化量的影响Fig.5 Effect of enzymolysis time on the conversion amount of xylose (a)and glucose(b)

由图5可知，在前72 h内随酶解时间的延长，酶解液中葡萄糖和木糖转化量均呈逐渐增加趋势，二者比较分析出木糖转化增加率比葡萄糖增加率高。酶解时间＞72 h后，由于时间过长发生副反应导致糖破坏致使木糖和葡萄糖的转化量均降低。因此，确定酶解时间为72 h。

2.2 响应面法优化玉米芯酶解条件

通过单因素试验，选择对还原糖转化量影响较大的硫酸体积分数（A）、加酶量（B）、酶解时间（C）三个因素为自变量，还原糖转化量（Y）为响应值，采用CCD试验设计试验设计结果与分析见表2，利用Design Expert 7.0软件对表2中的数据进行回归分析得方差分析结果见表3。

由表3可知，模型P值＜0.000 1，F值=90.53，影响极显著，所得模型合适。失拟项的P值=0.8514＞0.05，F值=0.04，影响不显著，决定系数R2＝0.993 9，拟合度＞90%，拟合度较好，可用此模型对影响还原糖转化量的试验因子做出分析。B、A2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），AB、AC对结果影响显著（P＜0.05）。因此各试验因子对响应值还原糖转化量的影响并不能以简单的线性关系表示，所得数据经回归拟合可得二次回归方程：

Y=443.97+6.92A+20.33B-6.45C-49.85A2+0.88B2-26.98C2-13.78AB+13.22AC-1.19BC

表2 CCD试验设计及结果Table 2 Design and results of CCD experiments

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

同时利用Design Expert 7.0软件，分别做出加酶量、硫酸体积分数、酶解时间交互作用对还原糖转化量影响的响应面图见图6。从图6中可直观地看出各因素间的相互作用、最佳参数。加酶量及因素交互作用对还原糖转化量的影响，曲线越陡影响越明显越大，对应于还原糖转化量的变化越大。对试验因子影响及交互作用分析得出加酶量这一因素对响应值还原糖转化量的影响最明显最大，加酶量和硫酸体积分数交互作用、酶解时间和硫酸体积分数交互作用显著，同方差分析结果一致。

图6 加酶量、硫酸体积分数及酶解时间交互作用对还原糖转化量影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between enzyme addition,sulfate concentration and enzymolysis time on the conversion amount of reducing sugar

经回归模型预测玉米芯预处理、酶解转化还原糖最佳工艺条件为硫酸体积分数0.76%、加酶量6.99%、酶解时间70.87 h，还原糖转化量理论值465.76 mg/g。对最佳工艺条件修正并验证，得出在硫酸体积分数0.8%、加酶量7%、酶解70.9 h条件下，还原糖转化量可达462.62 mg/g，其中木糖转化量为330.02 mg/g，葡萄糖转化量为132.60 mg/g，与预测值拟合度较好，证明此模型预测作用很好工艺参数合理可行。

3 结论

原料预处理可以破坏纤维的致密结构，使纤维素、木质素、半纤维素有效分离，可酶解性大大提高[11]。试验研究稀酸浸泡、纤维素酶和半纤维素酶水解转化玉米芯还原糖，并用响应曲面法对其工艺参数优化，得出最佳条件为：硫酸体积分数0.8%、90℃浸泡4h、料液比1∶15（g∶mL），在121℃条件下预处理60 min，加酶量（纤维素酶∶半纤维素酶1∶1）7%条件下酶解70.9h，还原糖转化量可达462.62mg/g，其中木糖转化量为330.02mg/g，葡萄糖转化量为132.60mg/g，还原糖转化率可达46.3%。该试验为进一步研究玉米芯发酵生产燃料乙醇提供理论依据。

[1]曲音波.非粮生物质炼制技术产业化的现状与展望[J].生物产业技术，2014,2(2):20-24.

[2]COULIER L,ZHA Y,BAS R,et al.Analysis of oligosaccharides in lignocellulosic biomass hydrolysatesby high-performance anion-exchange chromatography coupled with mass spectrometry(HPAEC-MS)[J]. Bioresource Technol,2013,133(2):221-231.

[3]王凤芝，常璇，马玉龙，等.酸解聚玉米秸秆的产物及其形成机制研究[J].中国粮油学报，2015，30（3）：1-5.

[4]田亚红，常丽新，王丽萍，等.玉米秸秆、玉米芯发酵生产乙醇的研究[J].食品研究与开发，2014，35（3）：47-50.

[5]中华人民共和国国家统计局.国家统计局关于2015年粮食产量的公告[EB/OL].(2015-12-08).http://www.stats.gov.cn/tjsj/zxfb/201512/t201 51208_1286449.html.

[6]姚笛，叶曼曼，李琳，等.响应面法优化玉米芯中低聚木糖的酶法提取工艺[J].中国粮油学报，2014，29（11）：14-18.

[7]方海兰.城市土壤生态功能与有机废弃物循环利用[M].上海：上海科学技术出版社，2014：330.

[8]罗鹏，王恩俊，徐琴琴，等.超临界二氧化碳及超声预处理促进玉米芯水解制备还原糖研究[J].生物质化学工程，2012，46（5）：29-32.

[9]王琛琛，张华山，王伟平，等.不同预处理方法对玉米芯还原糖含量的影响[J].食品与发酵科技，2011，47（5）：41-44.

[10]SIDIRAS D,KOUKIOS E.Simulation of acid-catalysed organosolve fractionation of wheat straw[J].Bioresource Technol,2004,94(1): 91-98.

[11]房桂干，刘姗姗，沈葵忠.杨木废弃物稀酸水解预处理条件的响应面优化[J].生物质化学工程，2014，48（6）：18-24.

[12]GALBE M,ZACCHI G.Pretreatment:the key to efficient utilization of lignocellulosic materials[J].Biomass Bioenerg,2012,46(12):70-78.

[13]CHEN W H,YE S C,SHEEN H K.Hydrolysis characteristics of sugarcane bagasse pretreated by dilute acid solution in a microwave irradiation environment[J].Appl Energ,2012,93(5):237-244.

[14]DAGNINO E P,CHAMORRO E R,ROMANO S D,et al.Optimization of the acid pretreatment of rice hulls to obtain fermentable sugars for bioethanol production[J].Ind Crop Prod,2013,42(2):363-368.

[15]SUN Y,CHENG J Y.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production:A review[J].Bioresource Technol,2002,83(1):1-11.

[16]CHEN X S,TANG L,LI S,et al.Optimization of medium for enhancement of ε-Poly-L-Lysine production byStreptomycessp.M-Z18 with glycerol as carbon source[J].Bioresource Technol,2011,102(2): 1727-1732.

[17]杨俊，刘江生，蔡继宝，等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定烟草中的水溶性糖[J].分析化学研究简报，2005，33（11）：1596-1598.

[18]杨盛茹，侯丽芬，丁长河，等.响应面法优化玉米芯预处理及酶解工艺的研究[J].河南工业大学学报：自然科学版，2015，36（4）：85-90.

Optimization of enzymolysis process of corncobs with dilute acid pretreatment by response surface methodology

YANG Shengru1,ZOU Jian1,DING Changhe2*,LIU Hongbin3,ZHANG Huang1(1.College of Food Engineering,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China;2.School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;3.China Animal Disease Control Center,Beijing 100125,China)

The conversion of lignocellulosic biomass to reducing sugar(glucose and xylose)was one of key processes in the fuel ethanol production. To increase the concentration of glucose and xylose,corncobs was pretreated with dilute acid firstly and hydrolyzed with cellulase and hemicellulase. The enzymatic hydrolysis conditions of corncob were optimized by single factor and response surface experiments using reducing sugar conversion amount as evaluation index,and the regression model according to the significances and interaction effects of acid concentration,enzyme addition and hydrolysis time on the sugar conversion amount was fitted.The results indicated that the optimum conditions was determined as follows:sulfuric acid concentration 0.8%,solid-liquid ratio 1:15(g:ml),121℃for 60 min,enzyme addition 7.0%(cellulose:hemicellulase 1:1)for 70.9 h.Under the condition,the reducing sugar conversion amount determined by HPLC reached 462.62 mg/g and conversion rate was up to 46.3%,including xylose 330.02 mg/g and glucose 132.60 mg/g.

corncob;dilute acid pretreatment;enzymolysis;response surface experiment;HPLC

TS261.9

0254-5071（2017）01-0111-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.023

2016-10-24

河南省高校科技创新人才支持计划项目（101HASYTIT035）；河南省科技攻关项目（142102110178）；河南省重点科技攻关项目（162102210107）

杨盛茹（1988-），女，硕士，研究方向为生物质乙醇发酵。

*通讯作者：丁长河（1968-），男，副教授，博士，研究方向为生物质乙醇发酵。