血清长链非编码脱氧核糖核酸KCNQ1重叠转录物1水平与冠状动脉病变的相关性研究

韩虎魁，何川，安闽生，金加发，张春伟，陈其军

血清长链非编码脱氧核糖核酸KCNQ1重叠转录物1水平与冠状动脉病变的相关性研究

韩虎魁，何川，安闽生，金加发，张春伟，陈其军

目的：探讨检测长链非编码脱氧核糖核酸（RNA） KCNQ1 重叠转录物 1（KCNQ1OT1）在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病） 患者血清中的表达及其临床意义。

冠状动脉疾病；脱氧核糖核苷类

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:36.)

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是冠状动脉粥样硬化改变后使冠状动脉狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏结构及功能的改变[1,2]。既往研究表明P53基因在动脉粥样硬化的

发生过程中同样发挥着非常重要的作用， P53的缺失能够显著加速动脉粥样硬化的发生、发展，但其具体机制尚未完全阐明[3,4]。长链非编码脱氧核糖核酸（RNA）是一类长度超过200 nt的非编码RNA[5]。众多研究结果提示在肿瘤的发生、发展过程中，长链非编码RNA均有参与并发挥着重要作用，然而长链非编码RNA在心血管系统疾病中的作用尚不明确[6]。有研究发现长链非编码RNA可以通过物理结合P53基因辅助活化子，作为P53通路中的一个重要组分参与到P53基因对下游基因的调控中去。本研究旨在研究长链非编码RNAKCNQ1 重叠转录物1（KCNQ1OT1） 在冠心病患者血清中的表达及意义，进一步揭示长链非编码RNA在心血管系统疾病中的作用及其可能的分子机制。

1 资料与方法

研究对象：选取2013-01至 2015-12期间在我院心内科就诊的患者196例，包括98例冠心病患者（冠心病组）和98例非冠心病患者为对照组。冠心病组:冠状动脉造影术显示有1支以上狭窄≥75%的患者。其中男性58例,女性40例,年龄35～88岁,平均年龄（59.2±15.0）岁。对照组: 选择同期就诊、与冠心病组患者年龄、性别及基本情况相匹配的无冠心病患者。其中男性48例,女性50例,年龄32～85岁,平均年龄（57.8±13.1）岁。所有患者间无血缘关系。采集外周血液样本同时收集临床资料, 包括性别、年龄、是否患有高血压、高脂血症、糖尿病等。所有入选病例确诊后即刻用含抗凝剂的紫色采血管采集静脉血静置于 4℃冷藏 30 min后，室温下 3 000 r/min离心 15 min，留取上层血清，置于-80℃冰箱备用。所有患者均签署知情同意书,经我院伦理委员会批准。

血清总RNA提取：将分离所得血清，置于冰上融化；取 250 μl 血清样品，加入 750 μl Trizol液，振荡器混匀，静置 5 min；加入 200 μl氯仿，振荡器混匀，静置 10 min；室温下12 000 r/min离心10 min，留取上清液并量取其体积，转移至另一个无RNA酶（Rnase） 的 EP 管中；分别加入与上清液等体积的异丙醇，振荡器振荡混匀，室温下静置 3 min；室温下12 000 r/min离心10 min；倒出管内液体，加用 1 ml 75%乙醇；室温 12 000 r/min 离心 2 min；倒出乙醇，并用 Tip 枪头将剩余液体吸干净，晾干。每管中加入 10 μl 无 Rnase 的 ddH2O，以能够充分溶解 RNA；用分光光度计测定总 RNA 浓度及纯度。

qRT-PCR分析长链非编码RNA KCNQ1OT1及P53基因的表达水平：提取血清总RNA，逆转录反应参照AMV 逆转录试剂盒说明，在 20 μl 体系中加 2 μg 总 RNA进行互补脱氧核糖核酸（cDNA）的合成。实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA 作为摸板，引物浓度 0.4 μmol/L，15 μl 体系进行扩增，每个待测样本设置 3 个平行样，根据目标基因设计合成相应上下游引物进行 PCR扩增，以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH） 作为内参照。KCNQ1OT1上游引物5’-CCCAGAAATCCACACCTC GG-3’； 下游引物5’-TCCTCAGTGAGCAGATGGAGA-3’；P53 上游引物5’- TACATGGGCCGAGGCAAGATAA-3’;下游引物5’- ATAGCCCAGGGAAGTG AAG GTGTC-3’PCR反应在定量 PCR 反应仪上进行。三次独立实验后得到的数据运用公式 RQ=2-ΔΔCt的方法进行分析。

统计学分析：采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，差异比较采用t检验，KCNQ1OT1与P53基因相关性分析采用线性回归法，KCNQ1OT1与各临床特征之间的关系使用Chi-Square检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较（表1）

两组患者一般资料比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表1 两组患者一般资料比较

表1 两组患者一般资料比较

注：1 mmHg=0.133 kPa

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2.2 两组患者血清中KCNQ1OT1与P53基因表达的比较

与对照组比较，冠心病组患者血清KCNQ1OT1表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001，图1A）；冠心病组患者中血清 P53基因表达水平较对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001，图1B）。

图1 实时荧光定量多聚酶链反应分析两组患者血清KCNQ1OT1及P53基因的表达（n=98）

2.3 两组肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I （cTnI）、冠脉Genisis 评分的比较（表2）

冠心病组CK、CK-MB、cTnI、冠脉Gensini评分分值均高于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组患者CK 、 CK-MB、 cTnI、Genisis 评分的比较

表2 两组患者CK 、 CK-MB、 cTnI、Genisis 评分的比较

注：CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTnI：心肌肌钙蛋白I

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2.4 冠心病组患者血清KCNQ1OT1与P53基因表达的相关分析

线性相关分析98例冠心病患者血清KCNQ1OT1与P53基因表达的相关性，结果提示KCNQ1OT1与P53基因的表达呈负相关关系（r=-0.856，P＜0.001，图2）

图2 冠心病组患者血清KCNQ1OT1与P53的相关性分析图

2.5 单因素及多因素Logistic回归分析（表 3）

以冠心病为因变量（有=1，无=0），以性别、年龄、吸烟、超重（BMI＞25 kg/m2）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、甘油三脂（TG）、糖尿病、高血压及血清KCNQ1OT1的表达为自变量，赋值后进行单因素非条件 Logistic 回归分析显示，年龄、吸烟、糖尿病、高血压、LDL-C、KCNQ1OT1表达、超重为冠心病的危险因素，差异有统计学意义（P＜0.0 5）。

进一步多因素Logistic回归分析发现年龄、吸烟、糖尿病、高血压、LDL-C水平及血清KCNQ1OT1表达是冠心病的独立危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05，表4）。

表3 冠心病危险因素的单因素Logistic回归分析

表4 冠心病危险因素的多因素Logistic回归分析

2.6 血清KCNQ1OT1诊断冠心病的受试者工作特征（ROC ） 曲线（图3）

ROC曲线评价血清KCNQ1OT1表达与冠心病的诊断是否有价值，患者血清KCNQ1OT1表达的敏感性为72.16%，特异性79.95%。ROC 曲线下面积（AUC）= 0.917，95% 可信区间为1.373～2.282。

图3 血清KCNQ1重叠转录物1表达对冠心病的诊断的受试者工作特征曲线图

3 讨论

目前对于冠心病的病因已有很多研究和假说，但其确切的发病机制尚有待进一步研究[9-11]。长链非编码RNA是一类不编码蛋白，长度超过200 nt的RNA，具有转录调节、染色质重塑及组蛋白修饰、调控剪接、形成内源性SiRNA、与蛋白质相互作用等8个方面的功能[12]。已有研究表明，长链非编码RNA在肿瘤的形成及发展过程中发挥着重要的作用。然而，长链非编码RNA在心血管系统疾病中的作用仍然尚不清楚[13,14]。近期研究发现一个名为Braveheart（Bvht）的长链非编码RNA，该长链非编码RNA与心肌细胞的维持和命运高度相关[15]。还有研究报道了长 链 非 编 码 RNA- ANRIL（CDKN2BAS） 与冠心病的患病风险性高度相关[16,17]。尽管如此，长链非编码RNA在心血管系统疾病尤其是动脉粥样硬化中的作用和分子机制仍不十分明确。前期通过基因芯片发现长链非编码RNA KCNQ1OT1在冠心病组患者血清中明显高于正常对照组，提示长链非编码RNA KCNQ1OT1可能参与调节冠心病的发生、发展。

KCNQ1OT1是一个位于 KCNQ1 位点的长链非编码 RNA 基因。印记基因是指仅一方亲本来源的同源基因表达,而来自另一亲本的不表达。KCNQ1OT1是一个印迹基因，只表达父源等位基因，它的转录物调控位于 11 号染色体 p 端 15.5 位置着丝粒的印记基因簇的其他印迹基因父源拷贝的沉默[18,19]。印记基因的异常表达引发伴有复杂突变和表型缺陷的多种人类疾病，印记基因的异常同样可诱发心血管疾病。但 KCNQ1OT1在冠心病患者中的具体作用，目前鲜有相关报道[20]。本研究发现与对照组比较，冠心病组患者血清KCNQ1OT1的表达明显增高，P53基因在冠心病组患者血清中的表达水平明显降低；血清KCNQ1OT1与P53基因的表达呈负相关关系。患者的年龄、吸烟、糖尿病、高血压、LDL-C水平及血清KCNQ1OT1的表达是冠心病的独立危险因素。本研究结果提示冠心病患者血清KCNQ1OT1表达显著增加, 可能是潜在的诊断和预测冠心病预后的血清标志物，但由于临床病例数有限，其具体机制仍需进一步扩大样本量的研究及分子生物学实验进一步证实。

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Correlation Study Between Serum Level of LncRNA KCNQ1OT1 Overlapping Transcript and Coronary Artery Lesion in Relevant Patients

HAN Hu-kui, HE Chuan, AN Min-sheng, JIN Jia-fa, ZHANG Chun-wei, CHEN Qi-jun.
Department Cardiology, Chengdu University Affiliated Hospital, Chengdu (610081), Sichuan, China Corresponding Author: HAN Hu-kui, Email: hanfukuimed@163.com

Objective: To investigate the serum expression of long non-coding RNA overlapping transcription content KCNQ1OT1 (KCNQ1) gene in patients with coronary artery disease (CAD) and its clinical significance.Methods: A total of 196 patients treated in our hospital were divided into 2 groups: CAD group and Control group, the patients were without CAD. n=98 in each group. Expression levels of serum KCNQ1OT1 and P53 were measured by quantitative RT-PCR; the relationship between KCNQ1OT1, P53 and clinical features in relevant patients were analyzed.Results: Compared with Control group, CAD group had increased expression of serum KCNQ1OT1 and decreased expression of P53, both P＜0.05. Correlation analysis revealed that the expression of KCNQ1OT1 was negatively related to P53 (r=-0.856, P＜0.001); multi Logistic regression analysis indicated that serum KCNQ1OT1 was independently related to CAD (P＜0.05).Conclusion: CAD patients had obviously increased serum level of KCNQ1OT1; KCNQ1OT1 was independently related to CAD occurrence.

Coronary artery disease; Deoxyribonucleosides

2016-04-23）

（编辑：常文静）

610081 四川省成都市, 成都大学附属医院 心内科

韩虎魁 硕士研究生 研究方向为冠心病发生发展及治疗 Email： hanfukuimed@163.com 通讯作者：韩虎魁

R54

A

1000-3614（2017）01-0036-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.01.009

方法：纳入我院收治的196例患者, 98例冠心病患者为冠心病组, 98例非冠心病患者为对照组。用实时荧光定量多聚酶链反应（qRT-PCR）检测血清KCNQ1OT1及P53基因的表达水平, 分析KCNQ1OT1与血清P53基因表达水平及临床病例特征的相关性。

结果：与对照组比较，冠心病组患者血清KCNQ1OT1的表达明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。P53基因在冠心病组患者血清中的表达水平明显低于对照组（P＜0.05）。线性相关分析发现血清KCNQ1OT1与P53基因的表达呈负相关关系（r=-0.856，P＜0.001 ）。多因素Logistic回归分析发现血清KCNQ1OT1的表达与冠心病存在独立相关（P＜0.05）。

结论:冠心病患者血清KCNQ1OT1表达显著增加, 并存在独立相关。