铅暴露对小鼠学习记忆能力的影响及机制研究

严伟伟 贾仰民 韩静茵 王淑娟

铅暴露对小鼠学习记忆能力的影响及机制研究

严伟伟 贾仰民 韩静茵 王淑娟

目的 研究铅暴露对小鼠学习记忆、海马凋亡细胞及乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响。方法健康昆明小鼠30只，随机分为对照组、醋酸铅暴露组，每组15只，分别予7mg/kg的生理盐水、醋酸铅连续腹腔注射8天。采用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆功能，羟胺比色法测定乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、TUNEL染色检测海马凋亡细胞。结果Morris水迷宫实验显示，醋酸铅暴露组小鼠第4、5天逃避潜伏期[（22.20±4.09）s、（19.73±2.88）s]、穿越平台时间[（15.54±3.72）s]均较对照组[（13.64±2.93）s、（11.79±2.24）s、（3.24±2.24）s]明显延长（P＜0.05）。醋酸铅暴露组小鼠AChE表达较对照组显著增高[（0.498±0.131）U/ug比（0.229±0.042）U/μg，P＜0.05]，且海马细胞凋亡率较对照组显著增多[（8.79±0.37）%比（2.79±0.04）%，P＜0.05]。结论铅暴露可明显损伤小鼠的学习记忆能力，小鼠海马凋亡细胞增加、中枢神经系统ACh含量的降低是其学习记忆功能障碍的一个可能机制。

小鼠；铅；学习记忆；凋亡细胞；乙酰胆碱酯酶

既往研究表明，铅是一种具有神经毒性的重金属，能影响儿童神经行为发育[1]，导致成人中枢神经系统病变[2-3]，包括记忆力损伤、阿尔茨海默症样病变及神经退行性病变等。但迄今为止，铅对学习记忆行为影响的机制仍未完全阐明。本研究通过建立醋酸铅暴露小鼠模型，观察其对学习记忆行为、海马凋亡细胞及乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响，探讨铅暴露对学习记忆行为影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物 健康昆明小鼠30只，清洁级，雄性，体质量20g～30g，由江苏常州卡文斯实验动物有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（苏）2011-0003。饲养环境：温度18～22℃，湿度50～60%。

1.1.2 试 剂 TUNEL凋亡检测试剂盒（凯基）、DAPI细胞染料（碧云天上海股份有限公司）、乙酰胆碱酯酶（AchE）测试盒（南京建成生物有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型构建及分组 健康清洁级昆明小鼠30只，随机分为对照组、醋酸铅暴露[4]组，每组15只。醋酸铅暴露组予醋酸铅7mg/（kg·d）腹腔注射，连续8天；对照组予等剂量生理盐水腹腔注射，连续8天。

1.2.2 Morris水迷宫实验 所有小鼠在造模后8天行水迷宫实验，并测试逃避潜伏期。将平台放入任一象限中央，进行定位航行实验，用于检测小鼠对空间记忆的获得能力：将小鼠从A、B、C、D 4个入水点面向池壁依次放入水中，观察60s内小鼠找到并爬上平台所用的时间（逃避潜伏期）。若60s内未能找到平台，则将其引导到平台并在平台上停留15s，潜伏期记为60s。空间探索实验用于检测小鼠对平台区域的准确记忆能力，是在水迷宫实验第5日、定位航行实验后撤去平台，由第2象限入水点面向池壁放入小鼠，观察小鼠60s内穿越平台区域的次数及平台象限游泳路程。

1.2.3 AChE活性检测 水迷宫实验结束后，水合氯醛处死实验小鼠，取出左右大脑半球，立即投入预冷的生理盐水中，清除血迹。用滤纸吸干水，去除软脑膜血管。取右脑称重，置微型匀浆器中，加无水乙醇0.1mL研磨，再加0.9mL生理盐水充分研磨制成匀浆。4℃ 4500xg离心15min,取上清液。用羟胺比色法测定AChE活性，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 TUNEL染色 取小鼠右脑制成脑片，常规脱蜡，经乙醇水合后PBS漂洗，蛋白酶K工作液消化，再次PBS漂洗，后将切片浸入3%H2O2封闭液中室温封闭，并再次PBS漂洗。将样本周围吸干，依次滴加TdT酶反应液、PBS漂洗，滴加FITC工作液、PBS中漂洗，滴加DAPI染料、PBS漂洗，最后使用荧光显微镜检测。结果说明：DAPI染色成蓝色，代表细胞核，TUNEL染色为绿色，代表凋亡细胞。凋亡率计算公式=TUNEL染色细胞数/DAPI染色细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠Morris水迷宫实验结果 在定位航行实验中，随着训练时间的延长，从第4天起，醋酸铅暴露组小鼠的逃避潜伏期时间较对照组小鼠明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。在空间探索实验中，醋酸铅暴露组小鼠穿越平台时间较对照组小鼠明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；但两组间穿越平台的距离差异无明显统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 两组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较（s，±s）

表1 两组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较（s，±s）

组别正常对照组醋酸铅暴露组F值P值只数15 15第1天57.63±1.05 54.54±1.31 0.642 0.997第2天13.42±2.78 13.43±2.34 1.414 0.094第3天16.33±3.756 19.95±3.515 1.142 0.083第4天13.64±2.93 22.20±4.09 0.509 0.043第5天11.79±2.24 19.73±2.88 0.609 0.011

表2 两组小鼠空间探索实验比较（±s）

表2 两组小鼠空间探索实验比较（±s）

组别正常对照组醋酸铅暴露组F值P值只数15 15距离（m）0.73±0.44 1.57±0.49 0.35 0.37时间（s）3.24±2.24 15.54±3.72 0.314 0.07

2.2 两组小鼠AChE活性比较 醋酸铅暴露组小鼠AChE表达（0.498±0.131）U/μg，较对照组小鼠（0.229± 0.042）U/μg显著增高，差异有统计学意义（F=6.3882，P=0.0062）。

2.3 TUNEL染色结果 对照组小鼠海马细胞凋亡率（2.79±0.04）%，醋酸铅暴露组小鼠海马区域细胞凋亡率（8.79±0.37）%，两组比较，差异有统计学意义（F=6.194，P＜0.05），见图1（封三）。

3 讨 论

铅是一种广泛存在的重金属，可通过消化道、呼吸道及皮肤进入机体。Morris水迷宫实验[5]，包括定位航行实验和空间探索实验，常用来评价啮齿类动物的学习记忆功能。本研究发现，铅暴露组小鼠的平均逃避潜伏期、穿越平台区域时间明显延长，表明铅暴露可明显损伤小鼠的学习记忆能力，与既往的研究结果相符[6]。

海马是学习记忆的重要解剖基础及神经中枢，其神经细胞任何形式的损害都可能导致学习记忆功能障碍[7]。同时，中枢胆碱能系统是形成学习记忆的主要通路，乙酰胆碱（ACh）是该通路中一种重要的神经递质[8]，但由于ACh的不稳定性，动物实验中较难检测ACh的浓度，因此我们选择其水解酶AChE活性的高低来评估ACh的含量。既往研究表明，AChE可分解ACh，使中枢神经系统的ACh含量降低，从而导致学习记忆功能障碍[9]。

本研究发现，与对照组相比，铅暴露组小鼠海马区域细胞凋亡增加，且铅暴露组小鼠脑组织内AChE表达显著增高（P＜0.05），提示小鼠海马凋亡细胞增加、中枢神经系统ACh含量的降低是其学习记忆功能障碍的一个可能机制。因此，调控海马神经元的凋亡、提高中枢神经系统的ACh含量，可能是改善小鼠学习记忆功能障碍的治疗方法之一。

［1］李廷玉，张萱，魏小平，等.出生时抗氧化维生素及重金属水平对两岁幼儿智力发育影响的相关分析［J］.中华儿科杂志，2011，49（6）：439-444.

［2］刘羽，郑珊，王红梅，等.铅对脑屏障系统的损伤及其机制的研究进展［J］.癌变·畸变·突变，2015，27（3）：245-248.

［3］黎东霞，杨莉，孙晓梅.血铅对铅从业人员认知障碍的影响［J］.现代医药卫生，2013，29（21）：3342-3343.

［4］张季，严春临，张丹参，等.大黄酚对铅中毒小鼠学习记忆的改善作用及其机制研究［J］.中国药理学通报，2011，27（11）：1614-1618.

［5］方松，余化霖.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：321-326.

［6］李静，刘芳丽，安伟锋，等.不同时期铅暴露对小鼠学习记忆能力及海马组织中β淀粉样蛋白表达的影响［J］.郑州大学学报(医学版)，2015，50（3）：323-326.

［7］张明，周民，丁向东.海马与记忆相关性的研究进展［J］.光明中医，2004，19（5）：21-23.

［8］卢昌均，韦冰心，安红伟，等.血管性痴呆模型大鼠空间记忆障碍与海马CA1区神经元凋亡和乙酰胆碱释放有关［J］.国际脑血管病杂志，2013，21（12）：898-902.

［9］Lazaris A，Bertrand F，Lazarus C，et a1.Baseline and 8-OH-DPAT-induced release of acetyleholine in the hippocampus of aged rats with different levels of cognitive dysfunction［J］.Brain Research，2003，967（1-2）：181-190.

（收稿：2016-08-09 修回：2016-08-28）

Effects of Lead Exposure on Learning and Memory of Mice and Its Mechanism

YAN Weiwei,JIA Yang min,HAN Jingyin,WANG Shujuan.Department of Occupational Medicine,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou (310003),China

Objective To investigate the effects of lead exposure on learning and memory,apoptotic cells in the hippocampus and the activity of acetylcholinesterase（AchE）of mice.MethodsA total of 30 healthy Kunming mice were randomly divided into control group（7mg/kg,normal saline）and lead acetate exposure group（7mg/kg,lead acetate）,with 15 mice in each group.The corresponding fluids were administered through continuously intraperitoneal injection for 8 d.The Morris water maze test was used to detect the learning and memory function of mice, hydroxylamine colorimetric method was used to measure AChE activity,and TUNEL staining was used to detect the apoptotic cells in the hippocampus.ResultsThe Morris water maze test showed that mice exposed to lead acetate group had longer escape latency time on Day 4 and Day 5（22.20±4.09s,19.73±2.88s）and longer time of crossing the platform（15.54±3.72s）than those of control group（13.64±2.93s,11.79±2.24s,3.24±2.24s,all P＜0.05）.The expression of AChE and the number of apoptotic cells in the hippocampus of lead acetate exposure group were sig nificantly higher than those in control group（AChE:0.498±0.131U/μg vs 0.229±0.042U/μg;apoptotic cells:8.79%± 0.37%vs 2.79%±0.04%;all P＜0.05）.ConclusionLead exposure can obviously damage learning and memory ability of mice.The increase of apoptotic cells in the hippocampus and the decrease of AChE in the central nervous system may be a possible mechanism of learning and memory dysfunction in mice.

mice;learning and memory;apoptotic cells;acetylcholinesterase

杭州市卫生科技计划（一般）项目（No.2014A41）

杭州市红十字会医院职业病科（杭州 310003）

严伟伟，Tel：13666653749；E-mail：ywwzj1006@163.com