1株产灵菌红素家族红色色素细菌的分离鉴定及其色素性质研究

李春燕，牟希，张媛，陈瑶，杨大成，郑鹄志，郑波，周佳海，蒋勇军，谢建平*

1(西南大学 生命科学学院，现代生物医药研究所三峡库区生态环境与生物资源省部共建国家重点实验室培育基地，重庆，400715) 2(西南大学 化学化工学院，重庆，400715)3(西南大学 地理科学学院，岩溶环境开放实验室，重庆，400715) 4(中国科学院 上海有机所，上海，200032)

1株产灵菌红素家族红色色素细菌的分离鉴定及其色素性质研究

李春燕1，牟希1，张媛1，陈瑶2，杨大成2，郑鹄志2，郑波4，周佳海4，蒋勇军3，谢建平1*

1(西南大学 生命科学学院，现代生物医药研究所三峡库区生态环境与生物资源省部共建国家重点实验室培育基地，重庆，400715) 2(西南大学 化学化工学院，重庆，400715)3(西南大学 地理科学学院，岩溶环境开放实验室，重庆，400715) 4(中国科学院 上海有机所，上海，200032)

对分离自重庆酉阳喀斯特槽谷石漠化地区土壤的1株产红色色素的细菌进行了形态学、生理生化特性和16S rRNA序列鉴定，进一步对该色素的溶解性、抑菌性和稳定性行进了研究，测定了其最大紫外吸收波长；同时，采用硅胶色谱柱对色素进行了纯化，通过薄层层析、质谱和光谱扫描对色素成分进行分析。结果显示，该菌在30 ℃培养时，色素产量较高。该色素在无水乙醇中的溶解性优于其他有机溶剂，在530 nm处有最大紫外吸收峰；该红色素对大肠杆菌(Escherichiacoli)及耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)无抑菌作用；对极端pH值较敏感，尤其是强碱性pH值。且其光和热稳定性良好，耐氧化能力较强，耐还原能力较弱；金属离子对该色素有不同程度的消色作用，Cu2+的消色作用最明显。16S rRNA序列分析结果显示，该菌与多株黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的16S rRNA序列一致。质谱分析结果显示，该色素的分子质量为324.2，与灵菌红素的分子质量非常接近，但光谱扫描结果与其不一致。

灵菌红素；粘质沙雷氏菌；色素；16S rRNA

色素包括天然色素和合成色素，广泛用于食品、化妆品、制药以及纺织等工业[1]。PERKINS等[2]于1856年首次合成了苯胺紫，此后，合成色素以其色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、品质均一、无臭无味、价格低廉等优点迅速取代了天然色素。但是合成色素的毒副作用使得大家更为重视天然色素。众多微生物如细菌、放线菌、酵母、丝状真菌和大型真菌都产生天然色素[3]，如红曲色素、天然蓝色素、类胡萝卜素和黑色素等[4-5]。我国对天然色素的研究开发发展迅速，在国际市场上的销售额年增长率始终保持在10%以上[6]。目前，我国批准使用多种天然色素如茶黄色素、茶绿色素、柑橘黄、红花黄、红米红、黑豆红、黑加仑红、花生衣红、姜黄素、焦糖色素等43种[7]。

本研究从重庆酉阳石漠化地区的土壤分离得到1株产红色色素的细菌，并对其进行了鉴定和该色素的性质做了初步研究探索了提取色素的参数、初步鉴定了该色素的性质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株

从重庆酉阳的花椒地采集的土壤中分离得到。

1.1.2 培养基

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min后备用。LB固体培养基：LB液体培养基中加入琼脂粉至终质量浓度为20 g/L。

7H9液体培养基：7H9粉末4.7 g/L，甘油0.2%，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，冷却后加入20%吐温-80至最终体积分数为0.05%。7H9固体培养基：7H9液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为20 g/L。

1.2.3 试剂与设备

PCR扩增用试剂，宝生物(工程)大连有限公司；DNA纯化回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；硅胶(300～400目)，烟台化学工业研究所。PCR仪，BIO-RAD公司；酶标仪，Molecular Devices公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离纯化

称取10 g土壤样品于10 mL无菌水，37 ℃摇床振荡过夜后，离心收集上清液；将上清液制备成10-4、10-5、10-6梯度的样品，取3个稀释度的样品各200 μL，分别涂布于LB固体培养基上[8]。30 ℃恒温培养2 d，挑取产红色素的菌落进行平板划线法分离纯化，直至得到纯的菌株后，转到LB液体培养基中，待其长到对数期时，加甘油保存于-70 ℃冰箱中。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 菌株形态及生理生化特征

取保存的菌液涂布于LB固体培养基，30 ℃培养2 d，观察菌落形态特征。另取菌液接种于LB液体培养，37 ℃培养1 d，经革兰氏染色后，于光学显微镜下观察其菌丝形态。

1.2.2.2 分子生物学鉴定

将培养好的菌液浓缩，沸水中煮30 min，离心收集上清，取2μL作为模板，进行16S rRNA基因扩增。16S rRNA的通用引物：27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1429R序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[9]。PCR扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物用回收试剂盒纯化后，送至华大基因公司测序。将所测序列在NCBI 的 GenBank 数据库中进行BLAST比对分析。

1.2.3 红色素性质的研究

1.2.3.1 红色素的制备与提取

从-70 ℃取出保存菌种，接种于LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min振荡培养过夜。以此为种子液，按200 μL/平板的接种量均匀涂布于LB平板，并于30 ℃培养箱培养36 h。用药匙刮下红色菌苔，置于无水乙醇(5mL/平板)中浸提色素。充分振荡混匀后于室温放置1 h，4 000 r/min，离心5min弃收集上清，按上述方法再重复浸提1次。过滤色素浸提液，减压浓缩至小体积，从而得到深红色色素乙醇浓溶液[10]。

1.2.3.2 红色素的光谱特征

对色素乙醇溶液作250～650 nm大范围波长扫描，得到色素光谱图，确定其特征吸收峰值。

1.2.3.3 红色素的的溶解性研究

按1.2.3.1的方法制备菌苔，并分为等质量的10份，分别取定量的水、甲苯、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、丙酮、三氯甲烷、异戊醇、石油醚等溶剂对其进行溶解，观察其在不同溶剂中溶解的难易程度[11]。并于最大紫外吸收波长测定其OD值。

1.2.3.4 红色素的抑菌性研究

将1.2.3.1浸提的色素乙醇弄溶液进行十倍梯度稀释，并用0.22 μm滤器过滤除菌。以大肠杆菌和耻垢分枝杆菌为供试菌株，采用滤纸片法进行平板抑菌实验，分别取10 μL各稀释梯度的色素进行实验，以确定红色素是否具有抗菌功能。

1.2.3.5 红色素的温度稳定性

取色素乙醇溶液，分别于40、60、80、100 ℃恒温水浴中孵育2 h，每隔30 min取样，测定其吸光值。

1.2.3.6 红色素的光稳定性

取色素乙醇溶液，分别置于白光和紫外光下，室温静置 0、2、4、6、8 h后取样，测定其吸光值。

1.2.3.7 红色素的pH稳定性

用HCl和NaOH将蒸馏水的pH值调至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，分别取5 mL各pH值的蒸馏水，再加入200 μL色素乙醇浓溶液，混匀后观察色素在不同pH条件下的颜色变化，并于静置后0 h和2 h测定其吸光值[10]。

1.2.3.8 红色素对氧化还原剂的稳定性

配制体积分数10%的H2O2和质量浓度100 g/L的Na2SO3，按下表(表1)制备反应体系。混合均匀后，测定静置0 h和2 h后的吸光值[12]。

表1 氧化还原反应体系

1.2.3.9 红色素对金属离子的稳定性

配制100 mmol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+溶液，取50 μL上述离子溶液分别加入450 μL色素乙醇溶液各，使其终浓度为10 mmol/L，混合均匀后，测定静置0 h和2 h后的吸光值[12]。

1.2.4 红色素的薄层层析分析

根据该色素的溶解性选用以下几种配方的展开剂：V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=3∶20，V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶30∶10，V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=15∶20∶40∶10，V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1，V(甲醇)∶V(石油醚)=1∶1，V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶10∶10，V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶5∶15。采用微型点样器吸取一定量的色素乙醇溶液进行点样，吹风吹干后置于上述展开剂中并密封，待展开剂的刻度线移至层析板前沿约2 cm时停止展开，将薄板取出晾干后拍照，采集分离图像并计算Rf值。

1.2.5 红色素的硅胶柱层析纯化与质谱鉴定

(1)样品准备：将预先制备好的色素乙醇溶液用旋转蒸发仪蒸至溶液还剩余2～3 mL时，加入少量的300～400目的硅胶，振摇，继续旋蒸直至蒸干，最后用刮刀刮下瓶中紫色固体备用。

(2)装柱：本实验采用湿法装柱、干法上样。称取适量的硅胶(300～400目)放入烧杯中，然后加入石油醚，使液面高出硅胶面2 cm，然后准备1支较长的玻璃棒，在装柱时边倒硅胶石油醚混合液边搅拌，使硅胶均匀沉降。并用双连球加压，压实硅胶柱。然后打开层析柱开关，放走多余的石油醚，待石油醚液面高出硅胶液面1～2 cm时关掉开关。

(3)上样：在层析柱顶端放上干燥的三角漏斗，小心将样品通过三角漏斗加入层析柱中，尽量使该固体平铺在硅胶面上，用适量石油醚洗下三角漏斗和层析柱壁上的固体。并用洗耳球清轻敲层析柱，使其平整。再通过三角漏斗加入适量无水碳酸氢钠，同时加适量石油醚，使无水碳酸氢钠约1.5 cm厚。

(4)洗脱：向层析柱加入40 mL石油醚，打开层析柱开关，当石油醚接近碳酸氢钠界面时，用滴管缓慢加入洗脱剂[V(无水乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5∶15]。并用试管收集流出液。

(5)浓缩：将收集到的橙红色溶液一起旋蒸，再将得到固体色素用少量甲醇溶解，保存于4 ℃冰箱。

(6)取2 mL纯化后的色素甲醇溶液送往中科院上海有机所进行质谱鉴定与红外扫描。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态鉴定

该菌株在LB平板上培养2 d后，菌落呈现鲜红色，且边缘整齐，表面光滑，中间有小凸起。革兰氏染色结果为阴性。

2.2 菌株的分子生物学鉴定

将16S rRNA的测序结果经BLAST比对发现，该细菌与多株粘质沙雷氏菌的16S rRNA序列一致，故初步推测该细菌属于粘质沙雷氏菌，因此其产生的色素可能就是灵菌红素。

2.3 红色素的紫外吸收光谱分析

红色素的紫外光吸收光谱见图1，250～650 nm波长扫描结果显示，该红色素乙醇溶液在530 nm处具有最大吸收峰，与灵菌红素的紫外吸收光谱一致，因此进一步证明该色素可能为灵菌红素。

图1 红色素的紫外吸收光谱Fig 1 The ultraviolet absorption spectra of the red pigment

2.4 红色素的溶解性研究

将红色素用不同的有机溶剂溶解，测得的OD530nm值见表2。结果表明，该红色素极易溶于无水乙醇和甲醇溶液，在水和丙酮中也能较好地溶解，表明该色素具有较强的极性；但在乙酸乙酯等其他几种有机溶剂中均不溶解，这与灵菌红素的脂溶性不一致。

表2 红色素的溶解性

2.5 红色素的抑菌性研究

实验中选取了2种菌做抑菌实验，37 ℃培养24 h后，结果见图2。从图2可看出，纸片四周没有透明圈，表明该红色素对供试菌株的生长没有明显的抑制作用，因而该红色素对大肠杆菌和耻垢分枝杆菌无抑菌作用。

(a)红色素对大肠杆菌的抑制效果；(b)红色素对耻垢分支杆菌的抑制效果图2 红色素的抑菌实验Fig 2 The bacteriostasis experiments of the red pigment

2.6 红色素的稳定性研究

2.6.1 红色素的温度稳定性

如图3所示，该色素在40 ℃和60 ℃时消色不明显，在80 ℃和100 ℃放置1 h后吸光值下降了十几个百分点，但后面就逐渐趋于稳定。在100 ℃放置2 h后，色素残留量还能达到87%以上，表明该红色素具有极强的温度稳定性。

图3 温度对红色素稳定性的影响Fig.3 Effects of temperature onthe stability of pigment

2.6.2 红素色的光稳定性

如图4所示，白光和紫外光对该色素的稳定性均无明显影响，持续照射8 h后，色素的残存率仍保持在95%以上，表明该红色素具有极强的光稳定性。

图4 光照色素稳定性的影响Fig.4 Effects of light on the stability of pigment

2.6.3 红色素的pH稳定性

如表3所示，该红色素在强酸性和强碱性溶液中均有沉淀生成。但其在酸性溶液中相对稳定，在pH4～6之间时，其残存率保留90%以上；但颜色有微弱的变化，和原样相比，其颜色呈水红色。在pH11～12之间，颜色呈橙黄色，明显变浅，且其残存率在pH12的时候已不到50%。在pH7～10之间，色素基本保持其原本的颜色和紫外吸收值。

表3 pH对红色素稳定性的

2.6.4 红色素对氧化还原剂的稳定性

如图5所示，随着氧化剂10% H2O2加入量的增加，色素的吸光值略有下降；终浓度1%时，其残存率还保留了66%以上，表明该红色素的抗氧化能力较强。而随着还原剂100 g/L Na2SO3加入的增加，色素的吸光值急剧下降；当其浓度为20 g/L时，OD值下降了72.84%，最低残留量仅有12.4%，表明还原剂对该红色素有很强的消色作用。

图5 氧化还原剂对色素稳定性的影响Fig.5 Effects of oxidizers and reducers on the stability of pigment

2.6.5 金属离子对红色素稳定性的影响

如表4所示，Na+和K+对色素的稳定性基本没有影响，而Li+、Ca2+和Mg2+对色素有一定程度的增色作用，其中，Li+的增色作用最明显。Cu2+使色素溶液变成了灰蓝色，吸光值大大降低。Fe2+和Fe3+加入后，生成了沉淀，颜色没有明显变化；而Zn2+和Mn2+使色素溶液变成了水红色，同时伴随沉淀的生成。

表4 金属离子对色素稳定性的影响

2.7 红色素的薄层层析分析

采用不同的展开剂对该色素进行分离，结果如表5所示，仅V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶10∶10与V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶5∶15能将其展开，但前者Rf值较大，展开效果不理想；后者Rf值接近0.5，展开效果最佳。

表5 不同展开剂对红色素的展开情况

2.8 红色素的硅胶柱层析纯化与质谱鉴定

图6 红色素的质谱鉴定图谱Fig.6 The mass spectrum of the pigment

经硅胶柱层析得到16 mg的固体色素。质谱鉴定如图6所示。结果显示，其分子量为324.2，与灵菌红素的分子量非常接近，但红外扫描结果与灵菌红素不符，推测该色素可能是灵菌红素的类似物。

3 结论与讨论

近年来，随着工业与生物医药技术的发展，天然色素以其安全可靠、来源广泛的特点，将重新取代大部分合成色素。灵菌红素更是具有多种生物学活性，研究表明灵菌红素具有抗肿瘤、抗菌及免疫抑制剂活性[13]。MELVIN等[14]研究发现灵菌红素对肾癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病、黑素瘤、中枢神经系统癌等8种癌细胞系中的57种不同人癌细胞均有起抗性作用。

天然的灵菌红素类化合物均含有一个共同的吡咯——双吡咯亚甲基的环状结构骨架。根据其侧链基团的不同，灵菌红素家族还包括灵菌红素25C(Prodigiosin 25-C)、盐酸环状灵菌红素(Cycloprodigiosin hydrochloride)、间环灵菌红素(Metacyaloprodigiosin)、壬基灵菌红素(Nonylprodigiosin)和环壬基灵菌红素(Cyclononylprodigiosin)[15-17]。体外抑菌试验表明，灵菌红素类物质对金黄色葡萄球菌及福氏志贺菌等革兰氏阳性细菌具有良好的抑菌作用[14]。因此灵菌红素具有独特的研究价值和应用潜能。

本研究分离得到的菌株经16S rRNA序列鉴定得知为粘质沙雷氏菌。对其产生的红色素性质进行研究发现，该色素与灵菌红素具有很多相似性，如稳定性好，紫外吸收光谱一致，且均具有良好的抗氧化能力。但本研究提取的色素不溶于脂类溶剂，且其红外光谱与灵菌红素不一致；根据以上这些结果推测，该色素可能是灵菌红素的类似物，或许存在一些未知的功能，因此还需进一步研究。由于本研究鉴定得到的分子量与灵菌红素极为接近，因此要获知其侧链基团与灵菌红素有何不同，还需对其分子结构作进一步解析。

致谢：感谢第三军医大学胡川闽教授和寰瑞生物技术有限公司唐世清博士。

[1] 王飞,罗海澜,刘畅,等.一株粘质沙雷氏菌的分离和产红色素初步研究[J].食品工业,2011(3):53-55.

[2] LIESKE B,KONRAD G.Thermal modification of sodium caseiante：Influence of temperature and pH on selected physicochemical and functional properties[J].Milcad，1994，49：1-20.

[3] 王君,张宝善.微生物生产天然色素的进展[J].微生物学通报,2007,34(3):580-583.

[4] 夏洁如,向晨茜,王洪伟.食用天然色素功能应用及发展趋势[J].中国酿造,2008(12):54-56.

[5] 苏龙,詹萍,陈旭健,等.微生物产天然红色素提取技术研究进展[J].玉林师范学院学报(自然科学),2008,29(3):84-86.

[6] 乔华.天然食用色素的稳定性的研究及应用[D].太原:山西大学,2006.

[7] 左玉.天然色素研究与应用[J].粮食与油脂,2006(9):46-48.

[8] 左勇,江鹏,叶碧霞,等.一株产蓝色素菌株的筛选及初步鉴定[J].食品工业科技,2016,37(3):166-170.

[9] YING Yi-xin,DING Wan-long,LI Yong.Characterization of soil bacterial communities in rhizospheric and nonrhizospheric soil of Panax ginseng[J].Biochemical Genetics,2012,50(11-12):848-59.

[10] 容杰,吴琦,刘文龙,等.一株沙雷氏菌红色素的理化性质研究[J].安徽农业科学,2010,38(1):10-12，18.

[11] 左勇,付彬,杨小龙,等.一株细菌产红色素提取条件的优化[J].中国食品添加剂,2016(6):96-101.

[12] 刘维,阮璐雅,管成林,等.一株铁皮石斛内生真菌H1B1 产红色素稳定性的研究[J].中国食品添加剂,2016(1):71-75.

[13] SIGAL NH,DUMONT FJ.Cyclosporine-a,fk-506,and rapamycin-pharmacological probes of lymphocyte signal transduction[J].Annual Review Immunology,1992,10:519-560.

[14] MELVIN M,TOMLINSON J,SALUTA G,et al.Double-strand DNA cleavage by cooper- prodigiosin[J].Journal of the American Chemical Society,2000,122:6 333-6 334.

[15] 袁保红.一种新的海洋细菌及其灵菌红素产生条件和生物活性的研究[D].广州:中山大学,2004.

[16] 王春玲.灵菌红素生物合成与分离纯化研究[D].合肥:合肥工业大学,2007．

[17] 盛磊,董卫,马雅静,等.灵菌素的制备与抗菌效果观察[J].农垦医学,1998(4):203-204．

The identification of prodigiosin family red pigment producing bacterium and characterization of the red pigment

LI Chun-yan1, MOU Xi1, ZHANG Yuan1, CHEN Yao2, YANG Da-cheng2,ZHENG Hu-zhi2, ZHENG Bo4, ZHOU Jia-hai4, JIANG Yong-jun3, XIE Jian-ping1*

1(Institute of Modern Biopharmaceuticals, State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environment and Bio-Resource of the Three Gorges Area, Key Laboratory of Eco-environments in the Three Gorges Reservoir Region,Ministry of Education, School of Life Sciences, Southwest University，Chongqing 400715,China) 2(School of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University，Chongqing 400715,China) 3(Karst Environment Laboratory, School of Geographical Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China) 4(Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Organic，Shanghai 200032,China)

Natural pigments are frequently used in food and dye industry. A bacterium producing red pigment was isolated from the Karst soil of Chongqing. The red pigment was characterized. The bacterium was identified asSerratiamarcescensby 16S rRNA sequencing. The optimum temperature for the bacterium to yield maximum pigment was 30 ℃. The maximum absorption peak of the pigment was at 530 nm. The pigment could be dissolved in different reagents, while the optimal extraction reagent was ethanol. It was quite stable over temperature, light and antioxidant, while unstable under reducing agent or alkaline condition. Cu2+could decolorize the pigment. The purified pigment did not show inhibitory effect upon Escherichia coli orMycobacteriumsmegmatis. The mass spectrum of this pigment was similar to that of prodigiosin.

prodigiosin;Serratiamarcescens; pigment; 16S rRNA

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701001

硕士研究生(谢建平研究员为通讯作者,E-mail：georgex@swu.edu.cn)。

国家自然科学基金(41472321)；国家重点研发项目(2016YFC0502304)

2016-07-18，改回日期：2016-08-29