益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变组织PCNA、GGT蛋白表达的影响 *

刘亚珠，李京涛△，魏海梁，闫曙光，何 超，陈晓婷， 常占杰

1.陕西中医药大学附属医院(咸阳712000),2.陕西中医药大学( 咸阳712000)

益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变组织PCNA、GGT蛋白表达的影响*

刘亚珠1，李京涛1△，魏海梁1，闫曙光2，何 超2，陈晓婷2， 常占杰1

1.陕西中医药大学附属医院(咸阳712000),2.陕西中医药大学( 咸阳712000)

目的：研究益脾养肝方对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌癌前病变病理组织和PCNA、GGT蛋白表达的影响。方法：将大鼠随机分成空白组、模型组、益脾养肝方大、小剂量组。采用腹腔注射DEN诱发大鼠肝癌前病变模型，给药16周后处死。观察大鼠一般情况和体重，肝功变化，肝组织HE染色以及免疫组化检测PCNA和GGT蛋白表达。结果：与模型组比较，养脾益肝方大、小剂量组的ALT、 AST、GGT和ALP均明显降低，其中YPYGF大剂量组效果最佳(P<0.01)。病理组织结果显示，益脾养肝方可以改善大鼠肝癌癌前病变的病理形态，能显著抑制肝组织PCNA和GGT的蛋白表达。结论：益脾养肝方对于大鼠肝癌癌前病变具有抑制作用，其作用可能与抗细胞异常增殖和抗细胞氧化损伤有关。

肝癌前病变是具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，介于正常组织和癌组织之间，如能阻止肝癌癌前病变的恶性进展，就有可能阻止或延缓肝癌的发生发展。益脾养肝方是陕西省名中医常占杰教授治疗肝硬化进展的验方[1-2]，长期临床随访提示该方可能具有抗肝癌癌前病变的作用。研究表明PCNA和GGT蛋白的表达与肝癌细胞增殖和肝细胞氧化损伤有密切联系[3-4]。本实验采用二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌癌前病变模型，观察益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变组织病理和PCNA、GGT蛋白表达的影响，为益脾养肝方抗肝癌癌前病变提供实验依据。

材料与方法

1 药品与主要试剂 DEN(0.95 g/ml)购于美国Sigma公司，PCNA、GGT试剂盒购买于陕西博达生物有限公司。DAB染色液、免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。

2 益脾养肝方的制备 益脾养肝方药(党参、白术、熟地、枸杞、姜黄、鳖甲、郁金、半枝莲、白花蛇舌草)，均由陕西中医药大学附属医院药剂科统一购买和制备冻干粉，每克含生药5 g，冻干粉密封保存于4℃冰箱内备用，使用时100℃水溶解，配置为小剂量0.5 g/ml和大剂量1.0 g/ml的药液。

3 动物造模 清洁级wistar大鼠70只，雄性，体重(100～120)g，购于西安交通大学实验动物中心。大鼠肝癌癌前病变模型制备[5]：大鼠适应性饲养3 d后进入实验，模型组和给药组均以0.5 ml/100g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(分2次给，即每84 h 1次)，连续给药16周；对照组给予等量无菌蒸馏水。

4 分组以及给药方法 将70只大鼠随机分为4组：空白组10只、模型组和益脾养肝方(YPYGF)大、小剂量组各20只/组。造模当日起，对YPYGF大、小组大鼠灌胃给予相应剂量药物：YPYGF小剂量(0.5g/ml)按10 ml/kg大鼠体重灌胃，1次/d。YPYGF大剂量(1.0 g/ml)按10ml/kg大鼠体重灌胃，1次/d。空白组、模型组大鼠同步灌胃等量无菌蒸馏水，直至16周末停药。

5 动物处理 于第16周处死大鼠。采用10%水合氯醛(0.3 ml/l00g)腹腔注射给药麻醉，待大鼠完全麻醉时，剪去腹毛，剖开腹腔，分离整个肝脏，拍照留取肝脏大体形态图。分别切取肝右叶、肝左叶、尾叶适当大小肝组织，于10%甲醛溶液常规固定。

6 肝组织HE染色和 PCNA及GGT蛋白表达 肝组织常规HE染色。肝组织于10%中性甲醛液固定24 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，4 μm切片，脱蜡脱水，3%H2O2室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min×2，5%～10%山羊血清封闭，室温孵育10 min，一抗4℃过2夜，二抗37℃孵30～60 min，滴加适量SABC，37℃孵育10～30 min，显色剂显色3～15 min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后显微镜下观察。

7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件，组间比较采用t检验和单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 一般情况和体重 空白组大鼠背毛光泽顺滑，活动和进食水均正常，无死亡。模型组、YPYGF大、小剂量组从实验第8周后，大鼠进食水量均减少，模型组死亡2只，YPYGF大、小剂量组各死亡1只。实验结束时各组大鼠体重有显著差异，体重顺序依次为空白组>YPYGF大剂量组>YPYGF小剂量组>模型组。

2 肝功能检测结果 益脾养肝方对肝癌癌前病变大鼠的肝功影响结果见表1。与空白组比较，各组大鼠的 ALT、 AST、GGT和ALP均明显升高。与模型组比较，YPYGF大、小剂量组的ALT、 AST、GGT和ALP均明显降低，其中YPYGF大剂量组效果最佳。经统计学分析，YPYGF大剂量组与模型组比较均有显著性差异(P<0.01)，YPYGF小剂量组与模型组比较，ALT、 AST和GGT有显著性差异(P<0.05)，而ALP无显著性差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠第16周肝功比较(U/L)

注： 与模型组比较，*P>0.05；与模型组比较，△P<0.05；与模型组比较，#P<0.01

3 组织病理结果 益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变病理组织的影响见图1。空白组肝小叶结构、肝索排列以及肝细胞核均正常，其余各组肝小叶结构破坏，增生细胞有异型性表现，可见双核细胞，肝小叶汇管区有淋巴细胞浸润和胆管增生等。与模型组比较，YPYGF两组的增生细胞异型性显著变小，双核细胞减少，并且炎症情况较轻，而YPYGF大剂量组效果更佳。

图1 各组大鼠病理组织结果比较(HE×100)

4 PCNA和GGT蛋白表达结果 益脾养肝方对大鼠肝癌癌前病变PCNA和GGT蛋白表达的影响见图2。由图可见模型组肝组织PCNA和GGT的表达均明显增强，主要见于癌前病变组织和周围组织。YPYGF大、小剂量组均能显著抑制PCNA和GGT的表达，大剂量组效果最佳。

图2 PCNA和GGT蛋白表达结果(HE×100)

讨 论

肝炎-肝硬化-肝癌，是肝病演进的“三部曲”，从肝硬化到肝癌会经历一个较长的肝癌癌前病变阶段[6]。2015年《原发性肝癌规范化病理诊疗指南》[7]指出：肝细胞癌癌前病变的病理类型可分为肝细胞异型增生、异型增生灶、低度异型增生结节(LGDN)、高度异型增生结节(HGDN)、肝细胞腺瘤(HCA)。中医“治未病”理论强调：未病先防，既病防变，如能筛选有效中药复方或单体延缓、阻断、甚至逆转肝癌癌前病变的恶性演进，从而阻止肝癌的发生。

益脾养肝方由党参、白术、熟地、枸杞、姜黄、鳖甲、郁金、半枝莲、白花蛇舌草九味药物组成，具有益脾养肝、行气活血，解毒散结的功效。本研究显示益脾养肝方能够改善大鼠肝癌癌前病变的病理形态，益脾养肝方两组的增生细胞异型性显著变小，双核细胞减少，并且炎症情况较轻，而益脾养肝方大剂量组效果更佳，说明益脾养肝方对肝癌癌前病具有抑制作用。

肝癌癌前病变的形成和恶性进展与细胞异常增殖、细胞氧化损伤密切相关[8-10]。PCNA的合成、表达与细胞增殖显著相关，在多种肿瘤的发生过程中均有着重要意义。PCNA阳性表达与肝细胞的异常增殖密切相关，PCNA 阳性细胞更具有癌变倾向。GGT的表达与肝细胞的氧化损伤明显相关，在癌变过程中GGT阳性颗粒的出现程度与肝细胞癌变过程呈正相关，GGT为肝癌发生的早期标志酶。本研究显示大鼠肝癌癌前病变肝组织PCNA和GGT均大量表达，PCNA主要在肝癌癌前病变组织和周围组织，而益脾养肝方能显著抑制PCNA和GGT的蛋白表达，大剂量组效果优于小剂量组。

综上所述，益脾养肝方对于大鼠肝癌癌前病变具有抑制作用，其作用可能通过抑制PCNA和GGT蛋白的表达，达到抗细胞异常增殖和抗细胞氧化损伤的作用。该研究结果为益脾养肝方抗肝癌前病变作用机制的深入探讨和进一步研究提供了一定的实验依据。

[1] 李京涛, 郭 师, 席 奇,等. 益脾养肝方联合肝动脉化疗栓塞术治疗原发性肝癌的疗效观察[J]. 陕西中医, 2015,36(8):944-945.

[2] 南 然, 宋春荣. 常占杰教授用益脾养肝法治肝病经验谈[J]. 光明中医, 2012, 27(12):2408-2409.

[3] 马文群,李利敏,宋国智. 增殖细胞核抗原与肿瘤关系的研究进展[J].河北医药，2011,33(4):600-602.

[4] 吴 芳，孙凤霞，徐春军. γ-谷氨酰转肽酶在肝脏疾病诊断和预后中的意义[J].中华实验和临床感染病杂志，2015,9(5)：616-620.

[5] 宋艺君, 杨史军, 王 湘, 等. 丹皮酚对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的预防作用[J]. 陕西中医, 2015,36(9):1270-1271.

[6] Tommaso L, Sangiovanni A, Borzio M,etal. Advanced precancerous lesions in the liver[J]. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2013, 27(2):269-284.

[7] 中国抗癌协会肝癌专业委员会, 中华医学会肝病学分会肝癌学组, 中国抗癌协会病理专业委员会, 等. 原发性肝癌规范化病理诊断指南(2015年版) [J]. 中华肝胆外科杂志, 2015,21(3):145-151.

[8] 张莉莉, 王 立. 肝癌癌前病变防治机制的研究概况[J]. 中国中西医结合杂志 ,2010 , 29(9):113-118.

[9] 黄晶晶, 黄鸿娜, 毛德文,等. 肝癌的癌前病变研究进展[J]. 辽宁医学杂志,2013,27(5) :26-28.

[10] 陈晓婷, 何 超, 李京涛,等. 中医药防治肝癌癌前病变的研究现状 [J]. 中西医结合肝病杂志,2016,26(5) :314-316.

(收稿：2016-09-11)

Compound Yipi Yanggan decoction exerts inhibits liver precancerous lesion by mediating expression of PCNA and GGT proteins

Liu Yazhu,Li Jingtao,Wei Hailiang ,et al.

The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine( Xianyang 712000)

Objective:To study the effects of Yipi Yanggan decoction on the amelioration of pathological morphology and expression of PCNA and GGT proteins in diethylnitrosamine (DEN) induced rat liver precancerous lesion. Methods : Rats were randomly divided into the normal control, the DEN group, and two Yipi Yanggan decoction (0.5, and 1.0 g/ml) treatment groups. The hepatic precancerous lesion model of male Wistar rats induced by intraperitoneal injection of DEN was used. After 16 weeks of administration, rats were sacrificed. To observate general conditions, body weight and liver function of rats. Liver tissues were measured by HE staining, and the expression of PCNA and GGT proteins of liver tissues were measured by immunohistochemical detection. Results : Compared with model group, ALT, AST, GGT and ALP of two Yipi Yanggan decoction groups were significantly lower, which the best was high-dose group of Yipi Yanggan decoction (P<0.01). Conclusion: Yipi Yanggan decoction can improve the rat liver precancerous pathological morphology, and can remarkably inhibit the cell abnormal proliferation and cellular oxidative damage.

Liver neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @ Liver precancerous lesion @ Yipi Yanggan decoction Animal experimentation Rsts @PCNA

*国家自然科学基金资助项目(81603612) 陕西省科技厅课题(2012SF2-11，2014K11-02-04-06, 2016SF-234)

肝肿瘤/中医药疗法 @肝癌前病变 @益脾养肝方 动物实验 大鼠 @PCNA

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.02.058

陕西省中医药管理局课题(15-JC009)

北京医学奖励基金会课题(YJHYXKYJJ-276)

△通讯作者