miR-155对前列腺癌放射治疗的增敏作用

董青川，张治国，程 继，王志刚，赵华才，赵文彩，张海艳，程永毅

miR-155对前列腺癌放射治疗的增敏作用

董青川1，张治国2，程 继1，王志刚1，赵华才1，赵文彩1，张海艳1，程永毅1

目的 探讨miR-155在前列腺癌放射治疗(简称放疗)中的增敏作用。方法 转染anti-miR-155，抑制前列腺癌DU145和PC-3细胞中miR-155水平，联合应用放射治1疗，通过观察DU145和PC-3细胞的存活率、黏附率，以及前列腺癌细胞的凋亡率，并观察Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性的变化。结果 与对照组相比，DU145和PC-3细胞经放射或anti-miR-155单独处理后，细胞存活率(放射组分别为25.6%±2.0%和21.6±1.0%；anti-miR-155处理组分别为20.5%±1.0%和15.5%±1.0%)和黏附率(放射组分别为0.8%±0.1%和0.7%±0.1%；anti-miR-155处理组分别为0.7%±0.1%和0.6%±0.1%)均显著降低(P<0.01)；前列腺癌细胞凋亡率增高(放射组分别为3.3%±0.3%和4.2%±0.3%；anti-miR-155处理组分别为4.1%±0.1%和3.9%±0.2%)；Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性均提高(P<0.01)；联合组的细胞存活率(分别为10.1%±0.5%和6.1%±0.5%)和黏附率(分别为0.4%±0.1%和0.4%±0.1%)低于单独处理组(P<0.01，n=6)，细胞凋亡率(分别为6.9%±0.4%和6.8%±0.3%)，Caspase-3和Caspase-9表达水平和活性等均高于单独处理组(P<0.01)。结论 抑制miR-155可增加人前列腺癌的放疗敏感性，提高放射线对人前列腺癌细胞的治疗效果，其机制可能与Caspase-3和Caspase-9参与细胞凋亡的途径相关。

miR-155；前列腺癌；放疗增敏；Caspase-3；Caspase-9

前列腺癌(prostate cancer, PCa) 严重威胁人类健康，是老年男性常见的恶性肿瘤。临床常规的治疗手段包括手术切除、放疗、化疗等，但患者复发率高、易出现耐药，存活率低。大多数晚期患者常伴有全身多器官转移，生存质量差。盆腔淋巴结是前列腺癌最早侵犯的部位，骨骼是前列腺癌常见的转移部位[1-3]。寻找新的治疗靶点，提高前列腺癌患者的生存率，改善生存质量，是目前本领域国内外研究的热点问题。

miRNA具有高度进化保守的特点，特异性低，是真核细胞中一类内源性非编码小分子RNA，长19～25个核苷酸，与靶mRNA的3’UTRs (untranslated regions) 互补结合，抑制蛋白合成，在基因表达中发挥重要调节作用，可以影响肿瘤细胞的生物学进程，调控细胞增殖、凋亡等过程[4，5]。研究表明，miR-155在前列腺癌细胞中高表达，参与调控前列腺癌发生、发展的过程[6，7]。据报道，miR-155可以增大肺癌等肿瘤的放疗敏感性[8，9]。本实验选择人前列腺癌DU145和PC-3细胞，通过抑制miR-155表达，同时联合放疗，观察前列腺癌细胞的生物学变化，同时分析其相关分子机制，以阐明miR-155对前列腺癌细胞的放疗增敏效应，为其临床应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 人前列腺癌DU145和PC-3细胞株(中科院上海生命科学院细胞库)。Anti-miRTM miR-155 抑制剂(anti-miR-155)和Anti-miRTM 阴性对照(美国 Applied Biosystems公司)。胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM培养液(Gibco公司)。二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)， Caspase-3和Caspase-9抗体(Sigma 公司)；Caspase-9和Caspase-3活性检测试剂盒(BioVision公司)。WDVE-6直线加速器(西门子，德国)。

1.2 细胞培养及分组处理 人前列腺癌DU145和PC-3细胞，DMEM培养液常规处理(含10%灭活胎牛血清，37 ℃，95%O2，5%CO2)，孵箱内培养。按照以下实验分组：对照组、放射组(5 Gy)，anti-miR-155处理组，放射(5 Gy)和anti-miR-155联合处理组(联合组)，取对数生长期细胞用于后续实验。照射条件：采用直线加速器发出的X射线为照射源，单次照射方式，从培养皿底部向上照射，源距离(SSD)=100 cm，照射面积10 cm×10 cm，剂量率=2 Gy/min。

1.3 细胞生长曲线测定 MTT法测定细胞生长曲线，取对数生长期的DU145和PC-3细胞，接种于96孔培养板，密度为5×103/孔，按上述分组分别处理细胞后，每孔加5 g/L的MTT 20 μl，37 ℃继续培养4 h，再加入二甲基亚砜 150 μl，室温孵育10 min。酶联免疫检测分析仪测定490 nm的吸光值。

1.4 细胞黏附试验 在24孔培养板上每孔加入层粘连蛋白溶液0.2 ml，37 ℃，过夜，PBS洗2次，再加入3%牛血清白蛋白0.2 ml，孵育2 h，PBS冲洗2 遍，包被备用。取1×105的单细胞悬液分别接种于已包被不同ECM的板内，按上述分组分别处理细胞后，弃去未黏附细胞，PBS冲洗，在显微镜下随机挑取10个不相关视野计数黏附细胞，计算黏附百分率。

1.5 Annexin V/PI 双染色流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的DU145和PC-3细胞，接种于6孔培养板，2×105/孔。按上述分组分别处理细胞后，继续培养24 h，收集细胞，PBS缓冲液冲洗，加入100 μl标记溶液 (FITC-Annexin V和PI，终浓度为1 μg/ml)，孵育10 min。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot分析Caspase-3和Caspase-9表达 取对数生长期的DU145和PC-3细胞，接种于6孔培养板，按上述分组分别处理细胞后，继续培养24 h，收集细胞，PBS冲洗，加入细胞裂解液， 4 ℃ 放置30 min，14 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭后，加入一抗(1∶1000)孵育，4 ℃ 过夜，加入二抗，室温孵育1 h。ECL发光试剂盒发光显影，收集图像。

1.7 Caspase-9和Caspase-3活性检测 按照上述分组，取对数生长期的DU145和PC-3细胞，按Caspase活性检测试剂盒操作程序，加入细胞裂解液，1500 r/min离心20 min，取上清，加入Ac-LEHD-pNA后混匀，室温条件下放置1 h，并测定405 nm处的吸光度值。

2 结 果

2.1 存活率 放射组和anti-miR-155处理组DU145和PC-3细胞的存活率均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；联合组的细胞黏附率显著低于放射组或Anti-miR-155处理组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 黏附率 与对照组相比，DU145和PC-3细胞经放射或anti-miR-155单独处理后，细胞黏附率均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；联合组的细胞黏附率显著低于放射组或Anti-miR-155处理组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3 凋亡率 与对照组相比，DU145和PC-3细胞经放射或anti-miR-155单独处理后，细胞凋亡率均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；联合组的细胞黏附率显著高于放射组或Anti-miR-155处理组，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表1 不同培养时间下各组对前列腺癌细胞存活率的影响 ±s；%；n=6)

注：与对照组比较，①P<0.01；与放射组或Anti-miR-155处理组比较，②P<0.01

表2 各组对前列腺癌细胞DU145和PC-3黏附率的影响 ；%；n=6)

注：与对照组比较，①P<0.01；与放射组或Anti-miR-155处理组比较，②P<0.01

表3 各组对前列腺癌细胞DU145和PC-3凋亡率的影响 ；%；n=6)

注：与对照组比较，①P<0.01；与放射组或Anti-miR-155处理组比较，②P<0.01

2.4 Caspase蛋白表达 Western blot结果显示，与对照组相比，DU145和PC-3细胞经放射或anti-miR-155单独处理后，细胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的水平均增加，而联合组的细胞，其Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平均显著高于放射组或Anti-miR-155处理组(图1)。

2.5 Caspase活性 如图2所示，放射组和anti-miR-155处理组DU145和PC-3细胞中的Caspase-3和Caspase-9活性均高于对照组；而联合组的细胞中，Caspase-3和Caspase-9活性均显著高于放射组或Anti-miR-155处理组(图2)。

图1 各组对前列腺癌细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的影响

A. DU145；B.PC-31。1.对照组；2.放射组；3.anti-miR-155处理组；4.联合组

图2 各组对前列腺癌细胞Caspase-3和Caspase-9活性的影响

A. DU145；B.PC-31；1.对照组；2.放射组；3.anti-miR-155处理组；4.联合组

3 讨 论

放疗是临床治疗前列腺癌的常规治疗之一，据报道，一些患者易出现辐射抵抗效应，从而降低了临床疗效[10，11]。因此，探索此抵抗效应在前列腺癌中发生的分子机制，同时寻找新的治疗靶点和策略，是目前本领域研究的热点问题，对于提高前列腺癌患者的临床治疗效果，改善患者的生存质量，具有重要的理论意义和临床应用价值。

miR-155与肿瘤的发生和发展过程密切相关，研究发现，miR-155不仅在前列腺癌细胞中高表达，同时可以增加肺癌等肿瘤对放疗的敏感性，这一效应与缺氧效应及FOXO3A的作用密切相关[7-9]。本研究通过特异性抑制前列腺癌DU145和PC-3细胞中miR-155的水平，观察其对前列腺癌生物学行为的影响。结果表明，抑制miR-155，能够显著降低DU145和PC-3细胞的增殖水平和黏附率，同时能够显著诱导细胞凋亡的发生，增高细胞凋亡率，这一效应与细胞中Caspase-3和Caspase-9的表达水平和活性有关；此外，我们还发现，抑制miR-155的水平，可以显著增加放射治疗的效果，显著抑制放射治疗细胞的增殖和黏附，同时增加Caspase-3和Caspase-9的表达水平和活性，从而促进放射治疗组细胞凋亡的发生，增加前列腺癌DU145和PC-3细胞的放疗敏感性。

在细胞的凋亡进程中，Caspase 家族成员起着关键的作用，Caspase-3和Caspase-9是关键分子，调控凋亡信号转导的过程[12，13]。上游FasL、TRAIL等信号分子与相应受体结合后，激活Caspase-3，启动死亡受体途径，诱导细胞凋亡的发生；细胞线粒体跨膜电位及通透性的改变，引起细胞色素C 的释放，从而激活Caspase-9，启动线粒体途径，诱导细胞凋亡的发生[14，15]。Caspase 活性与转录因子NF-κB家族成员关系密切，影响细胞凋亡的调控过程[16，17]。本实验结果也表明，miR-155的水平与Caspase-3和Caspase-9密切相关，提示，miR-155影响前列腺癌DU145和PC-3细胞的凋亡过程可能与上述两个Caspase分子有关，而这一关系也可能是miR-155增加前列腺癌放疗敏感性的分子机制之一。

本研究结果提示，抑制miR-155可以增加人前列腺癌的放疗敏感性，提高γ射线对人前列腺癌细胞的放射治疗效果，其相关机制可能与Caspase-3和Caspase-9参与细胞凋亡的途径相关。

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(2016-06-20收稿 2016-09-15修回)

(责任编辑 武建虎)

Effect of miR-155 on radiosensitivity enhancement of prostate cancer in vitro

DONG Qingchuan1, ZHANG Zhiguo2，CHENG Ji1, WANG Zhigang1, ZHAO Huacai1, ZHAO Wencai1, ZHANG Haiyan1, and CHENG Yongyi1.

1.Department of Urinary Surgery, People’s Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710068, China; 2 Department of Urinary Surgery, Changqing oil field worker hospital, Xi’an 710201,China

Objective To explore the effects of miR-155 on radiosensitivity enhancement of prostate cancer in vitro.Methods Cell viability and adhesion of DU145 and PC-3 cells were evaluated after anti-miR-155 transfection combined with irradiation therapy. Flow cytometry was performed to evaluate the cell apoptosis. The expression and activity of Caspase-3 and Caspase-9 were also observed after the above treatment.Results The results evidenced that cell viability(25.6%±2.0% and 21.6±1.0% in irradiated group；20.5%±1.0% and 15.5%±1.0% in anti-miR-155 transfected group) and adhesion of DU145 and PC-3 cells(0.8%±0.1% and 0.7%±0.1% in irradiated group；0.7%±0.1% and 0.6%±0.1% in anti-miR-155 transfected group) were inhibited obviously after anti-miR-155 transfection. The apoptosis rate(3.3%±0.3% and 4.2%±0.3% in irradiated group；4.1%±0.1% and 3.9%±0.2% in anti-miR-155 transfected group), Caspase-3 and Caspase-9 expression and activity were enhanced obviously compared with the control group(P<0.01).After combinative treatment, cell viability (10.1%±0.5% in irradiated group and 6.1%±0.5% in anti-miR-155 transfected group) and adhesion (0.4%±0.1% in irradiated group and 0.4%±0.1% in anti-miR-155 transfected group)decreased significantly(P<0.01，n=6).The apoptosis rate(6.9%±0.4% in irradiated group；6.8%±0.3% in anti-miR-155 transfected group) and the expression of Caspase-3 and Caspase-9 were also higher than the signal treated group(P<0.01).Conclusions Our results suggested that miR-155 can increase the radiosensitivity of DU145 and PC-3 cells and increase the efficiency of radiotherapy of γ-ray irradiation on prostate cancer in vitro.

miR-155; prostate cancer; radiosensitivity; Caspase-3; Caspase-9

陕西省科技攻关项目(2011JQ4017)

董青川,博士，主治医师。

1.710068 西安,陕西省人民医院泌尿外科；2.710201,陕西省西安市长庆油田职工医院泌尿外科

程永毅，E-mail：dongqc168@163.com

R737.25