仰韶陶香型高温大曲中挥发性香味物质分析

韩素娜，牛姣，侯建光

（河南仰韶酒业有限公司博士后研发基地，河南三门峡472400）

仰韶陶香型高温大曲中挥发性香味物质分析

韩素娜，牛姣，侯建光

（河南仰韶酒业有限公司博士后研发基地，河南三门峡472400）

以仰韶陶香型高温大曲为研究对象，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对大曲中挥发性香味物质进行定性分析，并结合半定量和主成分分析法对检测信息进行处理和分析。结果表明，在7块曲样中共鉴定出香味物质50种，主要分为6大类化合物，其中包括醛类8种，醇类5种，酯类7种，吡嗪类4种，酮类6种，酸类10种，芳香族类5种，烷烃类4种，杂环类1种。相对含量分别为15.91%、33.19%、7.5%、6.35%、2.2%、26.52%、6.23%、2.08%、4.18%。其中，乙酸、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、3-甲基丁酸、己酸、苯乙醇、十六酸乙酯、四甲基吡嗪、2-甲基丙酸含量相对较高，这些微量成分可能对后期白酒香味形成起着重大作用。

顶空固相微萃取法；气相色谱-质谱联用；香味成分；高温大曲

大曲是以大麦、小麦、豌豆、高粱等谷物为原料，粉碎、加水后压制，形成曲坯，然后人为控制一定的温度、湿度培育而成[1]。研究表明，大曲不仅是白酒生产的糖化剂和发酵剂，也是酿造原料的部分来源，其含有丰富的香味成分和香味物质前驱成分，在白酒生产过程中，这些物质直接或间接进入酒体，对白酒的香型和风格产生重大影响[2]。

大曲在白酒生产中的重要功能，吸引了很多研究人员对其进行研究。最初对大曲的研究主要集中在感官评定和理化指标的测定上，随后逐渐发展到微生物水平。近年来，随着对不同香型白酒风味成分研究的不断深入，大曲的生香功能越来越受到重视，对白酒大曲香味物质的研究可以帮助我们更好的认识白酒风味，从而为强化白酒香型，提高白酒质量提供指导。

本研究选取仰韶陶香型高温大曲为研究对象，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱(GC-MS)联用的方法[3-4]，对大曲中挥发性香味物质进行定性和半定量测定，并结合主成分分析法对检测信息进行处理和分析，以期获得陶香型高温大曲的主要挥发性香味物质，为后续大曲质量评价体系的完善和制曲生产标准化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品：高温大曲，由仰韶酒业有限公司制曲车间提供。

仪器设备：50μm/30μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取头，美国Supelco公司；三合一自动SPME进样器，美国Supelco公司；20m L带硅橡胶垫的样品瓶，美国Supel-co公司；Thermo Fishier1300-1310气相色谱-质谱联用仪，美国赛默飞公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集及处理

分别于不同库房用五点取样法采集多块大曲，由制曲生态园专业工作人员鉴定并挑选出优质曲样7块，分别编号为1，2，3……7。整块粉碎后全部过40目筛，混合均匀后采用四分法浓缩至500 g，装于无菌袋中保存于4℃冰箱中备用。

1.2.2 顶空固相微萃取（HS-SPME）条件

选取50μm/30μmDVAB/CAR/PDMS固相微萃取头，第一次使用时需于气相色谱进样口以230℃老化5m in。

萃取条件：精确称取3.0 g样品放入顶空瓶中，盖上瓶盖，70℃顶空萃取30m in，将萃取头取出插入GC-MS进样口解吸5m in，进行GC-MS分析。

1.2.3 气相色谱-质谱（GC-MS）分析条件

气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-FFAP，规格为60 m×250μm×0.25μm；自动不分流进样，进样口温度250℃；程序升温：35℃保持10m in，以10℃/m in升至130℃，保持2m in，再以6℃/m in升至230℃，保持30m in；载气：高纯度氦气，流速为0.81m L/m in。

质谱条件：EI电离源，电子能量70 eV，扫描范围30～550 u，离子源温度230℃，接口温度250℃。

1.2.4 定性与半定量分析

定性：检出挥发性组分物质的质谱图，通过与标准谱库（NIST05a.L）对比鉴定，匹配度大于800的鉴定结果予以确认。

半定量：以乙酸丁酯为内标，将大曲样品中鉴定的挥发性化合物的浓度与乙酸丁酯质量浓度作比进行计算。

1.3 数据处理方法

主成分分析法把原来众多具有一定相关的多个指标重新组合成一组新的互相无关的少数几个综合指标来代替原来的指标，从而使复杂问题简单化[5]。将各大曲样品的香味成分含量数据录入SPSS19.0，根据各样品香味成分含量的标准化值列出相关系数矩阵，计算特征值及其相应的特征向量，得到特征值、方差贡献率、累积贡献率，选取累积贡献率在85%以上的前几个成分作为主成分。

2 结果与分析

2.1 大曲样品挥发性香味物质定性分析

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测大曲中的挥发性物质，经计算机谱库查询，7组大曲样中鉴定出123种化合物，其挥发性成分的总离子流色谱图见图1。

结合相关文献中香味物质的报道，排除在少部分样品中发现，大部分样品中未检测出的香味物质，7组大曲样品中共获得挥发性香味物质50种，主要分为6大类化合物（见表1），其中，醛类8种，醇类5种，酯类7种，吡嗪类4种，酮类6种，酸类10种，芳香族类5种，烷烃类4种，杂环类1种，相对含量分别为15.91%、33.19%、7.5%、6.35%、2.2%、26.52%、6.23%、2.08%、4.18%。大曲是白酒酿造的动力，曲中含有丰富的香味物质，它们可以直接进入酒体，成为酒体中香味物质的直接来源，同时也是酒中香味物质的重要前驱物来源。

表1 大曲样品中不同种类挥发性香味物质总含量

相对含量最高的两大类主要是醇类和酸类物质，经过一定时间的贮存，在细菌、酵母和霉菌产生的酯酶作用下，这两大类物质将会大量合成酯类物质，进而赋予白酒更多的香味物质。

图1 总离子流图

酸是大曲和白酒中都很重要的呈味物质，在大曲中检出强度较大的为乙酸和2-甲基丁酸，这与汪玲玲[6]研究结果一致。

醛类物质占有较高比例（15.91%），其中含量最高的为3-糠醛，它是高温堆积中形成的，赋予大曲焦糊香。

酯类物质是大曲中存在的一类呈香物质，它为大曲香味的构成起着一定的贡献作用，其中含量最高的是十六酸乙酯，它呈微弱蜡香、果爵和奶油香味。

吡嗪类物质的形成与蛋白酶的作用和美拉德反应密切相关，特别在制曲顶温超过50℃时，有利于该类物质的产生，其中四甲基吡嗪含量最高，作为大曲中吡嗪类化合物的重要来源，它目前被视为中国白酒的有益健康成分进行研究[7]。

芳香族化合物是酒曲中另一类重要的化合物,它的含量占6.35%。芳香族化合物一般来源于原料中氨基酸，如苯丙氨酸类化合物的降解。此外，还有少量的烷烃类化合物以及一种杂环类化合物。这些化合物都是酒曲中的风味化合物。

表2 大曲样品中挥发性香味物质及含量(μg/g)

2.2 大曲样品挥发性香味物质半定量分析

内标物乙酸丁酯的含量已知，根据各种化合物的色谱峰面积与乙酸丁酯的色谱峰面积的比值，可初步得出每克大曲中各种挥发性化合物的含量。7组样品的各挥发性香味物质含量统计见表2。由表2可知，大曲中的挥发性香味物质种类丰富，含量各不相同。总体来看，乙酸、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、3-甲基丁酸、己酸、苯乙醇、十六酸乙酯、四甲基吡嗪，2-甲基丙酸含量较高，这些微量成分将对后期白酒香味形成起着重大作用。

2.3 大曲样品挥发性香味物质主成分分析

利用SPSS19.0软件对7组曲样中50种挥发性香味物质的含量数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA），得到主成分的特征值和贡献率，见表3，主成分载荷矩阵见表4。

表3 四大主成分初始特征值和累计贡献率

由表3可知，第1主成分贡献率为36.141%，第2主成分贡献率为25.095%，第3主成分贡献率为15.201%，第4主成分贡献率为12.957%，4个主成分累计贡献率达到89.272%。主成分分析一般提取包含85%以上信息，就可以代表原始数据的信息，而提取的4个主成分累计贡献率达到了89.394%，且4个主成分的特征值均大于1，可以较客观地反映各曲样的挥发性香味物质的原始信息。

载荷值主要反映各变量与主成分之间的相关系数。由表4可知,第1主成分主要与香叶基丙酮、3-羟基-2-丁酮、棕榈酸、2，3-环氧丙酸乙酯、四甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2,6,10-三甲基十二烷、苯酚、苯乙酸、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、正十四烷、4-苯基-四氢-2-呋喃酮、己酸乙酯、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、苯乙醇、十六烷有高的相关性，它们具有较高的载荷值，均大于0.7。第2主成分主要与2-吡咯烷酮、可卡醛、椰子醛、4-甲基戊酸、萘、3-糠醛、4-甲基愈创木酚、5-甲基吡咯-2-甲醛、植酮、香兰素、苯甲酸、2-羟基-4-异丙基萘有高的相关性，它们具有较高的载荷值，均大于0.7。第3主成分主要与十七烷、十四酸乙酯、己酸相关，载荷值，均大于0.7，第4主成分主要与壬酸相关，载荷值大于0.7。在这些香味物质中，载荷值较大的集中表现为酮类化合物，醛类化合物，吡嗪类化合物，酸类化合物，酯类化合物。由于第1主成分、第2主成分累计贡献率为61.236%，包含了原始信息中的大部分信息，所以其中载荷值较大的香味物质对曲香影响较大，确定为主要香味物质即香叶基丙酮、3-羟基-2-丁酮、棕榈酸、2，3-环氧丙酸乙酯、四甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2,6,10-三甲基十二烷、苯酚、苯乙酸、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、正十四烷、4-苯基-四氢-2-呋喃酮、己酸乙酯、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、苯乙醇、十六烷、2-吡咯烷酮、可卡醛、椰子醛、4-甲基戊酸、萘、3-糠醛、4-甲基愈创木酚、5-甲基吡咯-2-甲醛、植酮、香兰素、苯甲酸、2-羟基-4-异丙基萘。

3 结论

利用顶空固相微萃取（HS-SPME），结合气相色谱质谱法（GC-MS）测定仰韶酒厂曲库房中刚制的7房高温曲样品中的挥发性香味成分，共鉴定出香味物质50种，主要分为六大类化合物，其中包括醛类8种，醇类5种，酯类7种，吡嗪类4种，酮类6种，酸类10种，芳香族类5种，烷烃类4种，杂环类1种。相对含量分别为15.91%、33.19%、7.5%、6.35%、2.2%、26.52%、6.23%、2.08%、4.18%。同时利用内标法对这些香味成分进行半定量分析，总体来看，乙酸、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、3-甲基丁酸、己酸，苯乙醇、十六酸乙酯、四甲基吡嗪，2-甲基丙酸含量相对较高，这些微量成分可能对后期白酒香味形成起着重大作用。

对检测的50种挥发性香味物质含量进行主成分分析，共提取4个主成分，累计贡献率达到了89.394%，且4个主成分的特征值均大于1，可以较客观地反映各曲样的挥发性香味物质的原始信息。其中：第1主成分主要与香叶基丙酮、3-羟基-2-丁酮、棕榈酸、2，3-环氧丙酸乙酯、四甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2,6,10-三甲基十二烷、苯酚、苯乙酸、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、正十四烷、4-苯基-四氢-2-呋喃酮、己酸乙酯、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、苯乙醇、十六烷有高的相关性，它们具有较高的载荷值，均大于0.7。第2主成分主要与2-吡咯烷酮、可卡醛、椰子醛、4-甲基戊酸、萘、3-糠醛、4-甲基愈创木酚、5-甲基吡咯-2-甲醛、植酮、香兰素、苯甲酸、2-羟基-4-异丙基萘有高的相关性，它们具有较高的载荷值，均大于0.7。第3主成分主要与十七烷、十四酸乙酯、己酸相关，载荷值，均大于0.7，第4主成分主要与壬酸相关，载荷值大于0.7。在这些香味物质中，载荷值较大的集中表现为酮类化合物，醛类化合物，吡嗪类化合物，酸类化合物，酯类化合物。由于第1主成分、第2主成分累计贡献率为61.236%，包含了原始信息中的大部分信息，所以其中载荷值较大的香味物质对曲香影响较大，确定为主要香味物质即香叶基丙酮、3-羟基-2-丁酮、棕榈酸、2，3-环氧丙酸乙酯、四甲基吡嗪、3-甲基-1-丁醇、2,6,10-三甲基十二烷、苯酚、苯乙酸、三甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、正十四烷、4-苯基-四氢-2-呋喃酮、己酸乙酯、(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、2-甲基丙酸、苯乙醇、十六烷、2-吡咯烷酮、可卡醛、椰子醛、4-甲基戊酸、萘、3-糠醛、4-甲基愈创木酚、5-甲基吡咯-2-甲醛、植酮、香兰素、苯甲酸、2-羟基-4-异丙基萘。该研究结果为进一步量化评价大曲香味及完善大曲质量评价体系提供了参考。

表4 成分矩阵

[1]范文来,张艳红,徐岩.应用HS-SPME和GC-MS分析白酒大曲中微量挥发性成分[J].酿酒科技,2007(12)：74-78.

[2]崔利.形成酱香型酒风格质量的关键工艺是“四高两长,一大一多”[J].酿酒,2007,34(3)：24-35.

[3]明红梅,姚霞,周健,等.中高温浓香型大曲中挥发性香味物质分析[J].酿酒科技,2015(6)：73-79.

[4]周健,郭志,明红梅,等.优质中高温浓香型大曲主要香味成分的初步研究[J].酿酒科技,2014(4)：11-14.

[5]张力.SPSS在生物统计中的应用[M].厦门：厦门大学出版社, 2010.

[6]汪玲玲.酱香型白酒微量成分及大曲香气物质研究[D].无锡：江南大学,2013.

[7]吴建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代谢机理研究[D].无锡：江南大学,2013.

Volatile Flavoring Com ponents in Yangshao-flavor High-temperature Daqu

HAN Suna,NIU Jiao and HOU Jianguang
(Postdoctoral Research&Development Base,Yangshao Distillery Co.Ltd.,Sanmenxia,He'nan 472400,China)

In this study,Taoxiang high-temperature Daqu was used as the research object,and qualitative analysis of its volatile flavoring compounds was performed by HS-SPME coupled with GC-MS.Furthermore,the analytic results were processed by semi-quantitative and principal component analysis.The results showed that,50 kinds of volatile flavoring compounds in total were detected in 7 Daqu samples and they were mainly divided into 6 varieties including 8 kinds of aldehyde,5 kinds of alcohol,7 kinds of ester,4 kinds of pyrazine,6 kinds of ketone, 10 kinds of acid,5 kinds of aromatic compounds,4 kinds of alkanes,and 1 kind of heterocyclic with their relative contentas15.91%,33.19%, 7.5%,6.35%,2.2%,26.52%,6.23%,2.08%and 4.18%respectively;among them,the content of acetic acid,(2S,3S)-(+)-2,3-butanediol,3-methyl-butanoic acid,hexanoic acid,phenylethyl alcohol,hexadecanoic acid ethylester,tetramethyl-pyrazine and 2-methyl-propanoic acid was higher than others,and those compounds might make great contributions to the formation of liquoraroma.

HS-SPME;GC-MS;flavoring components;high-temperature Daqu

TS261.7；TS262.3；TS261.1

A

1001-9286（2017）02-0049-05

10.13746/j.njkj.2016304

2016-10-14

韩素娜(1973-)，女，高级工程师，国家评委，在职研究生，河南仰韶酒业有限公司总工程师。

牛姣(1988-)，女，硕士研究生，主要从事微量成分检测研究。

优先数字出版时间：2016-11-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161125.1239.003.htm l。