ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统在子痫前期患者母胎界面的表达及意义①

卢 敏 黄珊萍 郑林媚 许 艳

(海南省人民医院产科，海口570311)

ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统在子痫前期患者母胎界面的表达及意义①

卢 敏 黄珊萍 郑林媚 许 艳

(海南省人民医院产科，海口570311)

目的：探讨ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统在子痫前期患者母胎界面的表达及意义。方法：分别选取重度子痫前期、轻度子痫前期、妊娠期高血压患者各20例，另选同期行剖宫产的单胎初产健康妊娠妇女20例作为对照。检测并比较各组胎盘组织NO和cGMP水平、总NOS活性，免疫组化SP法检测胎盘组织eNOS和iNOS表达。高效液相色谱法检测各组脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)内ADMA水平。结果：重度、轻度子痫前期组胎盘组织NO水平分别为(7.6±3.6) μmol/g、(11.4±4.3) μmol/g，均显著低于对照组(均P<0.05)；重度、轻度子痫前期组胎盘组织cGMP水平分别为(3.26±0.31)pmol/g、(4.53±0.42)pmol/g，均显著低于对照组(均P<0.05)，且4组胎盘组织cGMP水平与NO水平呈正相关关系(r=0.672)；重度、轻度子痫前期组胎盘组织总NOS活性分别为(10.4±3.0)、(14.8±1.6 )U/mg蛋白质，显著低于对照组(均P<0.05)，4组胎盘组织总NOS活性与NO水平呈正相关关系(r=0.785)；重度、轻度子痫前期组胎盘组织eNOS表达显著低于对照组(均P<0.05)，重度子痫前期组iNOS表达显著高于对照组(P<0.05)；重度子痫前期、轻度子痫前期及妊娠期高血压3组HUVECs内ADMA水平均显著高于对照组(均P<0.05)，且4组患者HUVECs内ADMA水平与胎盘组织NO水平呈负相关关系(r=-0.582)。结论：ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统可能在子痫前期的发病中起重要作用。

子痫前期；非对称二甲基精氨酸；一氧化氮合酶；一氧化氮；环磷酸鸟苷

子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病，威胁母婴健康。在各种发病机制中，免疫遗传因素，特别是母胎界面的免疫耐受异常是目前的研究热点[1]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是最重要的内源性血管舒张因子，NO弥散进入血管平滑肌细胞后，可激活产生环磷酸鸟苷(cGMP)，启动一系列胞内生物学过程。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)和其主要内源性抑制物非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)在调节NO的表达和活性方面起重要作用。本篇通过研究子痫前期患者ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统的表达，探讨该通路在子痫前期发病中的作用和意义，以及免疫遗传因素在其中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年12月在本院产科住院并符合入组条件的孕妇60例，按分类标准分为3组，每组20例。入组条件：符合相应诊断标准，单胎初产妇，剖宫产终止妊娠，排除标准：原发性高血压、肝肾疾病、心脏疾病，急性炎症、糖尿病等合并症，胎盘早剥、前置胎盘等病理妊娠。A组为重度子痫前期组；B组为轻度子痫前期组；C组妊娠期高血压组。另选行剖宫产分娩的单胎初产健康妊娠妇女20例作为对照组(N组)。诊断和分类标准按人民卫生出版社第七版《妇产科学》。4组在年龄、孕周等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组病例均为海南地区汉族居民，无异族通婚史。本研究经本院伦理委员会同意，研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集与准备 胎盘标本：胎盘娩出后即刻取胎盘母体面组织2块(重分别为10 g、2 g)，冷盐水冲洗，其中1块(10 g)滤纸吸干后准确称重，置匀浆机中按比例制成10%的组织匀浆，2 000 r/min低温离心20 min后取上清液，置冻存管中-80℃保存；另1块置10%福尔马林溶液中固定备用。脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)：无菌状态下获取18～20 cm新生儿脐带，置4℃灭菌含双抗的PBS溶液中，4 h内参照常规方法[2]分离HUVECs，然后将其冻存于液氮备用。

1.2.2 NO检测 采用Griess法测定胎盘组织匀浆NO水平。按照NO检测试剂盒(南京建成)说明，测定管依次加入待测10%胎盘组织匀浆上清液、反应液振荡混匀，37℃水浴反应15 min，再加入终止液，紫外分光光度仪在540nm波长处测定OD值。然后根据公式计算出NO2-含量，以此来反映胎盘组织NO水平。

1.2.3 cGMP检测 取待测10%胎盘组织匀浆，用放射免疫法按照cGMP试剂盒(南京建成)说明，测定NO的第二信使cGMP水平。

1.2.4 胎盘组织总NOS活性测定 采用Griess法测定胎盘组织匀浆NO水平，此即间接代表胎盘组织总NOS活性。按照NOS检测试剂盒(南京建成)要求，测定管依次加入10%胎盘组织匀浆上清液、反应液振荡混匀，37℃水浴反应15 min，再加入终止液，分光光度仪在540nm波长处测定OD值。BCA蛋白定量试剂盒(Hycline,USA)测定组织匀浆上清液的蛋白含量。酶的活性定义为每毫克组织蛋白每分钟生成的1 nmol NO为一个活性单位。

1.2.5 胎盘组织eNOS和 iNOS的表达 采用免疫组化SP法。取各组胎盘标本，包埋、切片、脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性酶，修复抗原，加山羊封闭血清，滴加一抗(eNOS 1∶150，iNOS 1∶100)，漂洗后依次添加生物素标记二抗(羊抗兔IgG)和SABC试剂，DAB显色，苏木素复染。结果判定：参照Fromowitz[3]综合计分法，以胞浆出现明显的棕褐色颗粒或胞浆呈棕褐色为阳性，无着色或与背景颜色一致为阴性；随机选择5个高倍视野计数细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率并计分，无阳性细胞为0分，阳性细胞占1～25%为1分，26～49%为2分，≥50%为3分；并根据多数细胞的着色强度计算强度得分，无着色0分，浅棕褐色为1分，棕褐色为2分，深棕褐色为3分；阳性率和强度计分相乘的结果:0～1分为(-)，2分为(+)，3～4分为(++)，6分为(+++)，9分(++++)。

1.2.6 测定HUVECs内ADMA水平 取HUVECs解冻复苏后，培养传代，镜下观察细胞贴壁后，消化收集细胞，离心后取沉淀，加入同体积细胞裂解液，加入5-磺基水杨酸沉淀蛋白，混匀后离心，取上清液，用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)法测定ADMA水平(HPLC系统：LC-10Advp；色谱柱：Nova-Pak C18)。取10 μl待测样品或标准品(Sigma，USA)加入100 μl衍生试剂混匀，室温下反应3 min后进样分析。然后用线性梯度洗脱的方式将样品从色谱柱中洗脱，经预柱处理后，用荧光检测器对其及内标ADMA进行检测(激发波长338nm；吸收波长425nm)，并比较各组HUVECs内ADMA水平。

2 结果

2.1 4组患者胎盘组织中NO和cGMP浓度水平 重度子痫前期(A)组、轻度子痫前期(B)组患者胎盘组织NO水平分别为(7.6±3.6) μmol/g、(11.4±4.3) μmol/g，均显著低于对照(N)组(18.3±3.5) μmol/g(t=2.633、3.857，均P<0.05)。A、B组患者胎盘组织cGMP水平分别为(3.26±0.31)pmol/g、(4.53±0.42)pmol/g，均显著低于N组(7.26±0.31)pmol/g(t=2.846、3.824，均P<0.05)。4组胎盘组织中cGMP水平与NO水平呈正相关关系(r=0.672)。见表1。

2.2 4组患者胎盘组织总NOS活性测定 重度子痫前期(A)组胎盘组织总NOS活性为(10.4±3.0) U/mg蛋白质，轻度子痫前期(B)组为(14.8±1.6)U/mg蛋白质，妊娠期高血压(C)组为(17.8±1.6)U/mg，A、B组胎盘组织总NOS活性显著低于对照(N)组(t=3.157、2.352，均P<0.05)，A组胎盘组织总NOS活性也显著低于B组(t=2.136，P<0.05)，见图1。4组胎盘组织总NOS活性与NO水平呈正相关关系(r=0.785)。

2.3 4组患者胎盘组织eNOS和iNOS的表达 免疫组化切片显示4组胎盘绒毛血管内皮细胞、绒毛合体滋养细胞和细胞滋养细胞的胞浆中均可见eNOS和iNOS抗原的阳性表达。4组胎盘绒毛血管内皮细胞中的eNOS表达明显强于合体滋养细胞，而iNOS在绒毛合体滋养细胞中表达较其他细胞更明显(尤其是重、轻度子痫前期组)。重度子痫前期(A)组、轻度子痫前期(B)组胎盘组织的eNOS表达明显弱于对照(N)组(χ2=14.29、9.69，P<0.05)，见表2。N组、B组及妊娠期高血压(C)组胎盘各部分组织中iNOS表达均较弱，A组的iNOS表达显著强于N组(χ2=13.28，P<0.05)，见表3。

GroupsnNO(μmol/g)cGMP(pmol/g)Agroup2076±361)326±0311)Bgroup20114±431)453±0421)Cgroup20138±26586±025Ngroup20183±35726±031

Note：Compared to N group，1)P<0.05.

2.4 4组HUVECs内ADMA水平测定 重度子痫前期(A)组、轻度子痫前期(B)组及妊娠期高血压(C)组3组HUVECs内ADMA水平分别为(3.91±0.27)、(3.08±0.31)、(2.46±0.26 ) μmol/L，与对照(N)组比较均有显著性差异(t=4.542、3.815、2.808，均P<0.05)，见表4。4组患者HUVECs内ADMA水平与胎盘组织NO水平呈负相关关系(r=-0.582)。

图1 4组胎盘组织总NOS活性比较Fig.1 Activities of total NOS in placenta of four groupsNote: Compared to N group，△.P<0.05.

表2 4组胎盘组织eNOS表达比较

Tab.2 Expression of eNOS in placenta of four groups

Groupsn-++++++++++Agroup1)2067520Bgroup1)2038540Cgroup2024662Ngroup2003683

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

表3 4组胎盘组织iNOS表达比较

Tab.3 Expression of iNOS in placenta of four groups

Groupsn-++++++++++Agroup1)2013592Bgroup2065720Cgroup2069320Ngroup2078410

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

GroupsnADMA(μmol/L)Agroup20391±0271)Bgroup20308±0311)Cgroup20246±0261)Ngroup20136±012

Note：Compared to N group,1)P<0.05.

3 讨论

子痫前期的基本病理变化是全身小血管痉挛，血管内皮细胞的激活与损伤，以及各组织、器官灌流量减少。关于其病因和发病机理，国内外学者进行了大量的研究[4,5]，认为可能与遗传易感性、免疫失衡、胎盘滋养细胞缺血缺氧等原因有关。其中免疫学说和遗传学说相互影响和渗透，逐渐形成了免疫遗传学说[6,7]，并以免疫遗传因素，特别是母胎界面的免疫耐受异常作为子痫前期发病的起始因子。我们推测由于母胎界面的免疫耐受异常导致ADMA/NOS/NO/cGMP通路表达的改变，造成胎盘血管舒缩机制的紊乱，胎盘微小血管痉挛或收缩，最终出现子痫前期的病理生理改变。

NO是最重要的内源性血管舒张因子，广泛存在于血管内皮细胞中，它能抑制血管疾病的关键步骤[8,9]，如白细胞黏附、血小板聚集、血管平滑肌细胞增生等，也能抑制内皮素等缩血管物质的分泌，在稳定内皮功能、调节母体和胎儿胎盘循环中都起重要作用[10]。内皮细胞功能受损，NO合成不足时，血管收缩、血压升高、内皮功能不全、血小板聚集、血管平滑肌细胞增生，与子痫前期的病理生理改变极为类似。NO弥散进入血管平滑肌细胞后，可通过激活细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶产生cGMP，启动细胞内一系列蛋白磷酸化反应，发挥舒张血管、调节血压、保护内皮细胞等广泛的生理作用[11]。本研究验证了子痫前期患者胎盘组织中NO水平显著降低，其降低程度与子痫前期病情轻重密切相关，且胎盘组织中的cGMP水平与NO水平呈正相关关系。

NOS作为NO生成唯一、关键的限速因子[12]，它和其抑制物对NO生物学功能的发挥起着重要的作用。胎盘是妊娠时内源性NO合成的主要场所，含有大量具有NOS活性的滋养细胞及内皮细胞。NOS有三个亚型[13]，分别为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)，nNOS和eNOS通常参与生理状态下NO生成，而iNOS病理状态下可在细胞因子、免疫炎症等因素作用下产生大量iNOS，进而生成过量的NO发挥毒性效应。本实验结果显示妊娠期高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组胎盘组织总NOS活性均低于对照组，且活性依次下降，提示NOS活性降低程度可能与子痫前期病情轻重相关。免疫组化分别研究eNOS和iNOS表达，结果显示：重度、轻度子痫前期组胎盘组织中eNOS的表达均较对照组明显下降，推测子痫前期时内皮细胞受损，eNOS活性降低；而重度子痫前期组胎盘组织iNOS表达显著高于对照组，提示免疫炎症因素可能参与子痫前期的发病过程。我们推测可能是子痫前期时母胎界面的免疫耐受状态异常，免疫细胞或因子等被异常激活所致。

ADMA是主要的内源性NOS抑制物，主要由血管内皮细胞产生，其在局部组织和细胞内浓度远高于血浆中[14]，所以本实验仅检测HUVECs内ADMA 水平，以判断其对胎盘组织NOS活性的抑制程度，研究结果显示重度、轻度子痫前期组及妊娠期高血压组3组HUVECs内ADMA水平均显著高于对照组，且HUVECs内ADMA水平与胎盘组织NO水平呈负相关，表明ADMA水平变化可能与子痫前期的发病有关，且其变化程度与病情轻重相关。ADMA可以通过抑制内皮细胞内eNOS活性，减少NO生成，影响内皮依赖性血管舒张功能，被认为是子痫前期早期的预测标志[15]。

有关研究显示子痫前期患者体内ADMA水平升高与胎盘组织中ADMA水解酶，即二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohyd-rolase,DDAH)低表达有关[16]，胎盘组织中DDAH表达下降，通过调节ADMA代谢，影响eNOS活性，导致NO合成减少。人类主要组织相容性复合体(MHC)是参与移植免疫应答调控的最主要基因系统。而DDAH基因恰好位于MHC Ⅲ区域，有可能在调节宿主防御反应和免疫耐受中发挥重要作用。妊娠是一个半同种异体移植过程，胎儿携带父源性基因，却不被母体免疫细胞识别，此过程有赖于母胎间的免疫耐受，而此免疫耐受异常，则可能引起子痫前期等病理妊娠。

据此，我们推测母胎界面的免疫耐受异常导致位于MHC区域的DDAH基因异常表达和活性改变，通过影响体内ADMA的浓度，调节NOS活性及NO、cGMP水平，从而改变胎盘和全身微小血管的紧张性和内皮细胞功能，造成子痫前期相关病理生理改变。综上所述，ADMA/NOS/NO/cGMP通路系统可能在子痫前期病因和发病机理中的起着重要作用。今后，有待进一步明确DDAH的表达和调控机制，以完善该通路理论。

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[收稿2016-07-24 修回2016-10-10]

(编辑 张晓舟)

Expression and significance of ADMA/NOS/NO/cGMP pathway in maternal-fetal interface of patients with preeclampsia

LUMin,HUANGShan-Ping,ZHENGLin-Mei,XUYan.

DepartmentofObstetrics,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

Objective:To study the expression and significance of ADMA/NOS/NO/cGMP pathway in the maternal-fetal interface of patients with preeclampsia.Methods: 60 patients were selected and divided into severe preeclampsia group,mild preeclampsia group and gestational hypertensive group according to the disease condition,meanwhile 20 healthy pregnant women of singleton receiving cesarean section were chosen as control group.Levels of NO and cGMP in placenta of the four groups were detected and compared,and activities of total NOS in placenta were measured and compared.The expression of eNOS and iNOS in placental tissue was detected by immunohistochemistry SP method.High-performance liquid chromatography was used to detect the level of ADMA in HUVECs.Results: The levels of NO in placenta of severe and mild preclampsia groups were (7.6±3.6) and (11.4±4.3) μmol/g,which were statistically significantly lower than that in control group(P<0.05).The levels of cGMP in placenta of severe and mild preclampsia groups were (3.26±0.31) and (4.53±0.42)pmol/g,which were aslo significantly lower than that in control group(P<0.05).In the four groups,the level of cGMP in placenta was positively correlated with the level of NO in placenta(r=0.672).The activities of total NOS in placenta of severe and mild preeclampsia groups were (10.4±3.0)and (14.8±1.6)U/mg protein,which were statistically significantly lower than that in control group(P<0.05).In placenta of the four groups,the activity of total NOS was positively correlated with the level of NO(r=0.785).The expression of eNOS in placenta of severe and mild preeclampsia groups was statistically significantly lower than that in control group(P<0.05),the expression of iNOS in severe preeclampsia group was significantly higher than that in the control group(P<0.05).The levels of ADMA in HUVECs of severe preeclampsia group,mild preeclampsia group and gestational hypertensive group were statistically significantly higher than that in the control group(P<0.05).The level of ADMA in HUVECs was negatively correlated with the level of NO in placenta of the four groups(r=-0.582).Conclusion: ADMA/NOS/NO/cGMP pathway may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia.

Preeclampsia；Asymmetric dimethylarginine；Nitric oxide synthase；Nitric oxide；cGMP

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.019

①本文受海南省自然科学基金(琼科814320)、海南省卫生厅普通科研项目(琼卫13A210303)资助。

卢 敏(1978年-)，女，硕士，副主任医师， 主要从事病理产科基础与临床研究，E-mail： qiyoufei@aliyun.com。

R714.7

A

1000-484X(2017)01-0094-05