HIV感染者T细胞NKG2C/NKG2A表达及与疾病进展关系研究①

陶安福 何 磊 张子宁 傅雅静 刘 静 胡清海 姜拥军

(中国医科大学附属第一医院检验科 卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110001)

HIV感染者T细胞NKG2C/NKG2A表达及与疾病进展关系研究①

陶安福 何 磊 张子宁 傅雅静 刘 静 胡清海 姜拥军②

(中国医科大学附属第一医院检验科 卫生部艾滋病免疫学重点实验室，沈阳110001)

目的：研究HIV慢性感染者和HARRT治疗者T细胞NKG2C/NKG2A受体的表达变化，探讨其与疾病进展的关系。方法：选取HIV慢性感染者、接受HAART治疗的HIV感染者以及健康人的外周血细胞，通过荧光抗体染色，利用流式细胞仪检测T细胞上表达的NKG2C/NKG2A受体。结果：HIV慢性感染者NKG2C+T细胞，NKG2A+T细胞和NKG2C+NKG2A-T细胞百分比明显高于健康对照组 (P=0.025、P=0.032、P=0.029)，HARRT治疗组则明显低于HIV慢性感染者(P=0.033、P=0.037、P=0.018)，恢复到正常水平，与健康对照组相比无统计学差异。HIV慢性感染者外周血CD4+T淋巴细胞绝对数和表达NKG2A、NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T细胞呈负相关(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1)，HIV慢性感染者外周血T细胞上表达的NKG2C与NKG2A的比值与CD4+T淋巴细胞绝对数呈正相关(r=0.476,P=0.012)。结论：HIV感染者T细胞表面NKG2C和NKG2A的表达研究具有重要意义，为HIV感染的临床预后评估提供科学依据。

HIV感染者；T细胞；NKG2C；NKG2A

获得性免疫缺陷综合征，又称艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病，患者以CD4+T细胞减少为主要特征，同时伴有反复机会感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变，最终导致死亡，对人类的健康造成了极大威胁[1]。胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus dependent lymphocyte)， 又称 T 细胞，是来自胚肝或骨髓的始祖 T 淋巴细胞且在胸腺内完成分化发育和成熟。T 细胞表面分布一定数量的T 细胞受体(T cell receptor,TCR)，用于特异性识别抗原或者辅助相关功能[2]。NKG2家族属于C型凝集素家族，包括了NKG2A、NKG2C、NKG2E和NKG2D/F等[3,4]，分布于部分T细胞和NK细胞上。这些NKG2受体既有抑制性受体NKG2A/B，又有活化性受体NKG2C、NKG2D和NKG2E。其中NKG2A/B可与CD94形成二聚体，发挥抑制性作用；NKG2C和NKG2E与CD94、DAP12连接后形成活化性受体，传递活化性信号，增强细胞的杀伤能力[5]。

目前关于HIV慢性感染者和HARRT治疗者T细胞上NKG2A/NKG2C的研究和报道较少，尚无和疾病进展关系的研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 本实验共收集了70例受试对象，包括27例HIV慢性感染者(Chronically HIV infection,CHI)，21例HIV感染后进行HARRT治疗者以及22例健康对照者(HIV-negative normal control,NC)。健康对照者符合以下标准方可入组：HIV抗体阴性、无免疫系统疾病、血常规及肝功检查正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性。

1.1.2 主要试剂和仪器 单克隆荧光抗体：CD3-FITC(美国BD公司)，NKG2A-PE和NKG2C-APC(美国R&D公司)，溶血素(乙二胺四乙酸二钠0.037 g、氯化铵8.25 g、碳酸氢钾1.0 g、去离子水1 000 ml)，流式细胞仪：FACS Calibur和 FACS Aria(美国BD公司)

1.2 方法

1.2.1 CD4+T细胞绝对值检测 CD4+T细胞绝对值检测参照1997 年美国疾病预防控制中心制定的指导方法，应用FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，使用MultiSET软件分析得出CD4+T淋巴细胞绝对值。

1.2.2 HIV病毒载量测定 HIV病毒载量测定使用标准版模板制备法，提取500 μl血浆中的RNA，在COBAS AMPLICOR自动载量仪上采用Roche公司HIV-1 Monitor 1.5试剂盒以RT-PCR方法检测病毒载量，最低检测限是400 copies/ml。

1.2.3 外周血T细胞的百分数及细胞表面NKG2A、NKG2C受体的检测 应用荧光抗体CD3-FITC(美国BD公司)/NKG2A-PE(美国R&D公司)/NKG2C-APC(美国R&D公司)，加入100 μl EDTA抗凝全血，室温条件下避光 30 min。加入溶血素3 ml，室温条件下避光 8 min；洗涤3次，最后加入200 μl含有1%多聚甲醛固定液，应用FACS Aria流式细胞仪上机进行检测，采用BD FACS DivaTM软件分析实验结果。画门策略见图1。

1.3 统计学分析 应用SPSS20.0软件包进行统计分析，全部数据采用中位数表示，采用Mann-WhitneyU检验进行各组间的实验指标比较，采用Spearman秩相关检验进行相关性分析，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 T细胞上表达的NKG2C和NKG2A在健康对照者、HIV慢性感染者和HARRT治疗者的变化 我们检测受试对象外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A受体，结果显示T细胞上表达的NKG2C受体在CHI组有显著性升高(P=0.025)，HARRT组经过治疗后出现显著性下降(P=0.033)。T细胞上表达的NKG2A受体在CHI组比健康对照组有显著升高(P=0.032)，经过治疗后的HARRT组出现明显下降，具有统计学意义(P=0.037)。我们将NKG2C和NKG2A受体组合起来，观察在不同人群中的分布情况，发现CHI组NKG2C+NKG2A-T细胞出现显著性升高(P=0.029)，HARRT组经过治疗后出现明显下降，具有统计学意义(P=0.018)，见图2。

2.2 HIV慢性感染者外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A受体与CD4+T细胞数量的相关性 为了观察HIV慢性感染者外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A受体与疾病进展的关系，本实验统计了HIV慢性感染者的CD4+T淋巴细胞绝对数和病毒载量，并分别和外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A受体进行相关性分析，结果显示外周血CD4+T细胞数量和T细胞上表达的NKG2A受体百分数呈负相关(r=-0.697,P<0.000 1)，进一步观察NKG2C和NKG2A受体组合的表达情况，结果显示表达NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T细胞百分数和CD4+T细胞数量均成负相关(r=-0.463,P=0.015;r=-0.693,P<0.000 1)，而病毒载量和T细胞上NKG2C、NKG2A受体的表达无明显相关性(r=0.161,P=0.464;r=0.215,P=0.324)，见图3。

图1 画门策略Fig.1 Gating strategyNote: A.P1 gate is lymphocytes;B.P2 gate is CD3+ lymphocytes;C.The expressions of NKG2C,NKG2A in T cells,respectively.

图2 T细胞上表达NKG2C和NKG2A受体在健康对照者(NC)、HIV慢性感染者(CHI)和HARRT治疗者(HARRT)的统计比较Fig.2 Comparisons of NKG2C and NKG2A receptors expression on T cells in NC group,CHI group and HAART groupNote: A.Percentage of NKG2C expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;B.Percentage of NKG2A expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;C.Percentage of NKG2C+NKG2A- expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group.*.P<0.05.

图3 HIV慢性感染者(CHI)外周血T细胞上表达的NKG2A和NKG2C受体与CD4+ T细胞数量和病毒载量的相关性分析Fig.3 Correlation between NKG2A,NKG2C receptors expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells and HIV viral load in CHI groupNote: A.Correlation between NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;B.Correlation between NKG2C+NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;C.Correlation between NKG2C-NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;D.Correlation between NKG2C+ T cells and HIV viral load in CHI group;E.Correlation between NKG2A+ T cells and HIV viral load in CHI group.

图4 HIV慢性感染者(CHI)外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A的比值与CD4+ T细胞数量的相关性分析Fig.4 Correlation between NKG2C/NKG2A expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells in CHI groupNote: The absolute number of peripheral blood CD4+ T lymphocytes has positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expres-sed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals.

2.3 HIV慢性感染者外周血T细胞上表达的NKG2C和NKG2A的比值与CD4+T细胞数量呈正相关关系 除了分析NKG2C和NKG2A受体单独表达以及联合表达与CD4+T淋巴细胞绝对数的相关关系，我们进一步统计分析了HIV慢性感染者外周血T细胞上NKG2C/NKG2A的比值和CD4+T细胞数量，发现两者呈正相关(r=0.476,P=0.012)，见图4。

3 讨论

T细胞是人体适应性免疫应答的重要效应细胞，成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，广泛接触进入体内的抗原物质，通过 T 细胞抗原受体(TCR)的第一信号和共刺激分子第二信号的协同刺激激活细胞[6,7]，并可经淋巴管、外周血和组织液等发挥细胞免疫及免疫调节等功能，长期保持免疫记忆能力。NKG2A和NKG2C作为共同作用于配体HLA-E上的一对抑制性受体和活化性受体，除了在NK细胞上表达，在T细胞上亦有一定的表达，对T细胞内信号的传递产生影响。HIV感染之后机体的免疫系统被激活，作为活化性受体的NKG2C，通过识别人类细胞上表达的HLA-E以及DAP-12，传递活化性信号给靶细胞，增强T 细胞的杀伤能力。NKG2A是抑制性受体，通过识别人类细胞上表达的HLA-E，NKG2A表达增加，抑制细胞的功能。由于NKG2家族受体的报道主要集中于单一受体的表达，很少对两种不同作用的受体在同一细胞表面表达进行研究，考虑NKG2C和NKG2A作为一对共配体HLA-E的受体分子，单独研究一种受体只能片面地反映细胞的功能变化，我们对活化性受体NKG2C和抑制性受体NKG2A同时进行检测，将会更全面地反映出HIV慢性感染者和HARRT治疗者外周血T细胞在HIV感染后的变化。

我们在实验中观察到NKG2C+和NKG2A+以及NKG2C+NKG2A-T细胞在慢性感染者中出现显著性增长。NKG2C受体的增多会传递更多的活化信号，调节细胞的免疫功能；HIV感染引起全身免疫系统的活化，进而导致抑制性受体NKG2A反馈性增多。NKG2A受体的增多又抑制了细胞的免疫功能，导致HIV慢性感染者体内病毒持续的存在和扩增。目前关于T 细胞上NKG2受体家族有部分报道， Mingari[8]和De Maria[9]研究发现抑制性受体是通过对细胞毒性T细胞的抑制效应来降低对病原体的清除。我们观察的NKG2A是一种抑制性受体，T细胞上表达的NKG2A数量在感染HIV后出现显著性增长将抑制机体免疫系统对HIV病毒的清除。Magdalena[10]在感染HSV-1的小鼠模型中发现CD8+T 细胞表面表达NKG2A/C/E受体出现明显增长，小鼠模型中的实验结果有力支持了我们在HIV感染者外周血中看到的结果，即T细胞上表达的NKG2A受体和NKG2C受体在HIV慢性感染者中出现明显增长。而Miller等[11]在感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的小鼠模型中发现在抗原特异性的CD8+T 细胞表面高表达NKG2家族，但是当疾病进入慢性进展期后，NKG2家族受体数量出现了下调。我们分析Miller研究的对象小鼠感染的是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒，而本实验的研究对象人感染的是HIV病毒，因此两个实验虽然检测同样的实验指标，实验结果存在一定的差异。

HARRT组经治疗后出现了显著性下降，且与健康对照者相比无统计学差异，说明经过治疗后机体的免疫系统得以改善。很多接受HARRT治疗的患者经检测发现病毒载量低于检测下限， CD4+T 细胞绝对数也有不同程度增长，其体内T细胞表面表达的NKG2A和NKG2C以及NKG2C+NKG2A-的数量随着疾病进展均出现了显著性下降，恢复到正常人水平。Costa[12]在实验中发现HIV-Ⅰ型病毒感染者在未治疗时CD8+T细胞CD94/NKG2A表达升高，经6个月的抗逆转录病毒治疗表达未显著减少，经24个月的治疗后可恢复至与健康对照人群无差异的水平。而我们实验选取的HARRT治疗组全部标本距离开始治疗的时间均小于两年，经过HARRT治疗后观察到T细胞上表达的NKG2A受体和NKG2C受体数量和健康对照组比较没有统计学差异。两组实验结果中NKG2家族受体的恢复时间有差异，考虑可能是由于两组实验收集的人群不同造成的，Costa观察的是典型HIV感染者，且前期抗病毒感染治疗失败，而我们收集的HARRT组患者都属于初次治疗。

CD4+T细胞数量是衡量人体机体免疫力的重要指标之一。本实验通过检测HIV慢性感染者CD4+T细胞数量，并和外周血T细胞上表达的NKG2A和NKG2C受体进行相关性分析时发现， NKG2A+T细胞、NKG2C+NKG2A+T细胞以及NKG2C-NKG2A+T细胞与CD4+T细胞数量成反比例关系，提示T细胞表面NKG2A+，NKG2C+NKG2A+以及NKG2C-NKG2A+的表达将是研究疾病进展的重要指标，对于HIV感染临床预后评估具有重要意义。

本实验进一步统计分析了HIV慢性感染者外周血T细胞上NKG2C/NKG2A的比值和与CD4+T淋巴细胞绝对数的关系，结果提示两者呈正相关关系。由于HIV进入人体后在靶细胞中复制增殖，可通过直接或者间接途径攻击和破坏CD4+T 淋巴细胞，导致CD4+T 淋巴细胞绝对数显著减少，功能严重障碍。实验结果显示HIV慢性感染者外周血T细胞上NKG2C/NKG2A的比值越低，CD4+T淋巴细胞绝对数越少，机体的免疫功能越低下，NKG2C/NKG2A的比值可作为临床上预后评估判断的依据之一。

综上所述，本实验研究了HIV慢性感染者和HARRT治疗者外周血中T细胞表达的NKG2C和NKG2A受体的变化，首次分析了NKG2A和NKG2C受体与CD4+T 淋巴细胞绝对数的相关性，提示T细胞表面NKG2C/NKG2A受体表达在HIV感染中具有重要意义，为临床上治疗HIV感染和预后评估判断提供科学依据。而人体感染HIV后表达NKG2C和NKG2A受体的T细胞功能如何变化目前尚无报道，还有待后续进一步的实验去探索和研究。

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[收稿2016-06-01]

(编辑 倪 鹏)

Research on expression of NKG2C/NKG2A receptors on T cells in HIV infected individuals and relationship with disease progression

TAOAn-Fu，HELei，ZHANGZi-Ning，FUYa-Jing，LIUJing，HUQing-Hai，JIANGYong-Jun.

KeyLaboratoryofAIDSImmunologyofMinistryofHealth，DepartmentofLaboratoryMedicine，theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China

Objective:To study the changes of NKG2C/NKG2A expressed on T cells in HIV chronically infected individuals and HAART-treatment AIDS patients and the relationship with disease progression of HIV.Methods: We collected peripheral blood from HIV chronically infected individuals,HAART-treatment AIDS patients and healthy human and used the flow cytometry by staining fluorescent antibody to detect the NKG2C/NKG2A receptors expressed on T cells.Results: NKG2C+,NKG2A+and NKG2C+NKG2A-expressed on T cells in HIV chronically infected individuals were significantly higher than the healthy control group (P=0.025，P=0.032，P=0.029),while in HAART-treatment AIDS patients were significantly lower than that in HIV chronically infected individuals (P=0.033，P=0.037，P=0.018),returned to the normal levels with no significant difference compared with the healthy control group.The absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes in HIV chronically infected individuals was negative correlation with T cells which expressing NKG2A+，NKG2C+NKG2A+and NKG2C-NKG2A+(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1).What was more,the absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes had positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expressed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals(r=0.476,P=0.012).Conclusion: Studying the expression of NKG2C and NKG2A receptors on T cell has great significance in HIV infected individuals,which may provide a scientific basis for clinical prognosis of HIV infection.

HIV infected individuals;T cells;NKG2C;NKG2A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.018

陶安福(1991年-)，男，在读硕士，主要从事艾滋病免疫学研究，E-mail：taftaf@163.com。

R512.91

A

1000-484X(2017)01-0090-05

①本文为十二五科技重大专项(2014ZX10001002-001-004)和基础临床紧密结合平台项目(医大发字[2013]5号)。

②通讯作者，E-mail：jiangjun55555@163.com。