类风湿性关节炎患者嗜碱性粒细胞活化机制研究①

兰巧芬 廖焕金 陈秋华 蔡 珺 张莉芳 彭艳霞 何一鸣 吴 平 谢 彤 潘庆军

(广东医学院附属医院临床医学研究中心，湛江524001)

·临床免疫学·

类风湿性关节炎患者嗜碱性粒细胞活化机制研究①

兰巧芬 廖焕金②陈秋华③蔡 珺④张莉芳 彭艳霞④何一鸣③吴 平 谢 彤③潘庆军④

(广东医学院附属医院临床医学研究中心，湛江524001)

目的：探讨类风湿性关节炎患者外周血嗜碱性粒细胞的活化情况及其机制。方法：流式检测正常人对照组和RA患者组外周嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c的表达及IL-4阳性的比例；用电化学发光法检测血清IgE水平；负选正常人嗜碱性粒细胞，以anti-IgE刺激为阳性对照，置含或不含IgE的微环境中，流式检测CD203c的表达及IL-4阳性的比例。结果：较正常人对照组，RA患者嗜碱性粒细胞高表达CD203c和IL-4(均P<0.05)；RA患者血清IgE水平显著高于正常人对照组(P<0.05)；RA患者血清和其血清中纯化的IgE可使负选的正常人来源的嗜碱性粒细胞活化，上调CD203c表达及IL-4阳性比例。结论：RA患者嗜碱性粒活化与发病相关，且主要由IgE介导，靶向嗜碱性粒细胞及其活化通路有望为RA的防治提供新的策略。

类风湿性关节炎；嗜碱性粒细胞；活化；IgE；IL-4

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种典型的自身免疫性疾病，免疫功能紊乱及免疫调节失衡是其在发病过程中的重要因素，尤其T、B淋巴细胞免疫应答失衡被认为是RA发病的核心所在，其中辅助性T细胞(Th1/Th2和Th17/Treg)等应答失衡在RA疾病进展中的重要作用已被广泛认知[1]。

近年，嗜碱性粒细胞作为一群曾被忽略的小群体重新赢得了尊重，除参与过敏反应外，在免疫调节等方面也具有重要作用[2]，如系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)、RA等。活化是嗜碱性粒细胞发挥其生物学功能的关键步骤，多种途径可介导嗜碱性粒细胞的活化，进而分泌大量介质(IL-4/IL-6/组胺等)，同时，表面上调一系列免疫分子(CD40/CD40L/CD62L/HLA-DR/BAFF/CCRs/CXCRs等)，参与多种免疫细胞功能的调节[3]，如促进Th2型细胞分化[4,5]，是Th2细胞分化所必需的IL-4的一个重要起始来源[6]，也可抑制Th1分化[7]等。

本课题前期曾提出嗜碱性粒细胞参与RA发病的假说[8]，基于此，本研究拟通过检测RA患者临床标本和体外实验，探讨RA患者外周嗜碱性粒细胞活化机制，有望为RA的防治提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 2014年7月～2015年12月在广东医学院附属医院风湿免疫科明确诊断RA的患者45例，平均年龄为(49.5±1.6)岁。所有入选的患者诊断符合1987年美国风湿病学会RA分类标准及2009年ACR和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)提出新的RA分类标准和评分系统。将所有入组RA患者的疾病活动度按照DAS28进行评分，其中RA患者5例为低活动度，20例为中活动度，20例为高活动度，另有22例同期健康志愿者(男4例、女18例)作为正常人对照组，平均年龄(46.7±2.5)岁。

1.1.2 试剂及仪器 流式抗体PE anti-human CD203c、PE Mouse IgG1、κIsotype Control、PE-Cy7 anti-human IL-4、PE-Cy7 Mouse IgG1均购自Biolegend公司；Goat anti-Human IgE抗体购自Sigma公司；Anti-Human IgE antibody购自Abcam公司；BFA/Monensin mixture(×250)购自Multiscience公司；嗜碱性粒细胞负选试剂盒EasySep Human Basophil Enrichment Kit及HetaSepTMBuffer购自Stemcell公司；溴化氰活化高速4B琼脂糖购自GE Helthcare公司；胎牛血清及1640培养基购自Gibco公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体购自碧云天生物技术公司；人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物科技公司；固定液、染色液及×10穿透液购自eBioscience公司。电化学发光免疫分析仪为Roche Diagnostics GmbH的Cobase 601；磁极EasySepTMMagnet购自Stemcell公司；流式细胞仪为BD公司的FACSCantoTMⅡ型；CO2培养箱为Heraeus公司。

1.2 主要方法

1.2.1 流式细胞术检测嗜碱性粒细胞活化情况 采集RA病人和正常人对照组EDTA 抗凝的外周静脉血，密度梯度离心法获得PBMC。PBS洗涤后分别加入4支流式管(A、B、C、D)并用染色液重悬，A、C、D管加入PE标记的鼠抗人CD203c 抗体，B管滴加与抗体相等量的同型对照抗体，混匀，避光孵育30 min；PBS洗涤后加入固定液混匀，室温避光孵育15 min，A、B管用PBS洗涤离心。C、D管再加入通透液混匀，1 500 r/min×6 min 离心洗涤一次。弃上清，加入通透液，C管滴加PE-Cy7标记的鼠抗人IL-4抗体，D管滴加相等量的同型对照抗体，避光孵育40 min。PBS洗涤重悬后用流式细胞仪进行检测。以CD203c同型对照组为基准画门，确定嗜碱性粒细胞阳性表达位置，接着对嗜碱性粒细胞进行设门。以同型对照为基准确定IL-4的阳性表达位置。

1.2.2 RA患者血清中IgE水平的检测 全部入组的患者以及健康对照组外周静脉血分离的血清经罗氏Cobase 601化学发光免疫分析仪检测IgE(包括游离的IgE和含IgE的免疫复合物，即与特异抗原结合形成的CIC)。

1.2.3 亲和层析纯化IgE 取适量的溴化氢活化的琼脂糖微球置于1 mmol/L HCl中悬浮溶胀，与anti-human IgE抗体一同加入含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L NaHCO3(pH=8.3)偶联液中，4℃过夜。转移到0.1 ml Tris-HCl(pH=8.0)，常温反应2 h，装柱，用含有0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=4.0)和含有0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8)交替洗涤，用PBS洗涤平衡柱子至pH=7.2～7.4。将血清样品上样，再用PBS平衡柱子至pH=7.2～7.4。用0.1 mol/L(pH=2.4)甘氨酸-HCl洗脱，洗脱下的溶液立即用1 mol/L NaHCO3中和至pH=7.2～7.4，然后浓缩，并用化学发光免疫分析仪进行检测定量，用Western blot分析制备好的IgE。

1.2.4 正常人外周血嗜碱性粒细胞的负选 采集EDTA抗凝的外周血，HetasepTM分离液分离多型核细胞并将细胞浓度调整为5×107个/ml，置于5 ml的聚苯乙烯材质的管中。加入负选试剂盒中的 EasySep Human Basophil Enrichment Cocktail 50 μl/(ml cells)，混匀，常温孵育10 min，再加100 μl/(ml cells)的Nanoparticles，混匀，常温孵育10 min。加入含有2%FBS和EDTA的PBS至2.5 ml，吹打混匀，放入EasySepTMMagnet磁极中，常温放置5 min。将整个磁极拿起，轻轻倾斜倒出细胞液，重复3次。最后收集的细胞悬液为嗜碱性粒细胞。用台盼蓝检测其活性并用流式检测纯度。

1.2.5 IgE的微环境对嗜碱性粒细胞的活化情况 将嗜碱性粒细胞悬液种于12孔板内(5.0×105个/孔)，设A、B、C、D、E五孔。A孔细胞的培养基中添加20%的正常人血清；B孔细胞的培养基中添加20%RA患者的血清；C孔细胞的培养基中添加了已去除IgE的20%的RA血清；D孔细胞的培养基中添加纯化的IgE(5 μg/ml)；E孔细胞培养基中添加anti-IgE抗体，作为阳性对照组。另外，各孔同时添加IL-3(终浓度为10 ng/ml)以维持嗜碱性粒细胞的存活。于37℃、5%CO2养箱内培养，30 min和12 h后，分别检测CD203c的水平及IL-4阳性比例情况。

2 结果

2.1 正常人对照组和RA患者组外周嗜碱性粒细胞活化情况 RA患者组外周血嗜碱性粒细胞表达CD203c的水平(MFI)高于正常人对照组(P<0.05)，见图1，而不同活动度组间无显著性差异。

2.2 正常人对照组和RA患者组外周血IL-4阳性嗜碱性粒细胞的比例 RA患者外周血IL-4阳性嗜碱性粒细胞的比例高于对照组(P<0.05)(图2A)；当评分为低中度时，IL-4阳性的比例高于正常人对照组和高活动度组(P<0.05)，高活动度组与正常人对照组无统计学意义(P>0.05)，见图2B。

图1 正常人对照组和RA患者组外周血嗜碱性粒细胞CD203c表达情况Fig.1 Expression of CD203c on basophils from RA patients and healthy controlsNote: Basophils were identified by the expression of CD203c;A.The abscissa representatives fluorescence intensity of PE-CD203c;B.RA patients (n=30),healthy controls (n=18),**.P<0.01.

2.3 RA患者组和正常人对照组血清IgE水平的比较 RA患者组血清IgE水平显著高于正常人对照组(P<0.05)，见图3A。低中活动度组和高活动度组分别与正常人对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，低中活动度组与高活动度组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。

2.4 RA患者来源的IgE可活化正常人来源的嗜碱性粒细胞 通过免疫印迹检测纯化浓缩后的IgE和去除IgE的血清，发现亲和层析方法可以有效地分离RA血清中的IgE，进而得到高纯度的IgE和去除IgE的血清(图4)。

流式检测正常人外周血负选前和负选后的嗜碱性粒细胞纯度，发现负选后可得到高纯度的嗜碱性粒细胞(图5)。

将正常人来源的嗜碱性粒细胞分别置于含正常人血清(Control)、RA患者血清(Serum,RA patients)、去除IgE的RA患者血清(IgE free,RA patients)，以及RA患者血清纯化的IgE(purified IgE,RA patients)的培养液中刺激30 min和24 h，以anti-IgE抗体刺激组为阳性对照，各组嗜碱性粒细胞CD203c的表达(图6A)和IL-4阳性比例(图6B)显著不同。

图2 正常人对照组和RA患者组外周血IL-4阳性嗜碱性粒细胞比例Fig.2 Proportion of IL-4 positive basophils in RA patients and healthy controlsNote: A.RA patients (n=30),healthy controls (n=18);B.Low and medium activity RA group (n=16),and high activity RA group (n=14).*.P<0.05.

图3 正常人对照组和RA患者组总IgE水平比较Fig.3 Total serum levels of IgE in RA patients and healthy controlsNote: A.RA patients (n=30),healthy controls (n=18);B.Healthy controls (n=18),low and medium activity RA group (n=16),and high activity RA group (n=14).*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 免疫印迹检测亲和层析分离的RA患者IgE Fig.4 Western blot detection of IgE purified by affinity chromatography from RA patients

图5 负选正常人外周血细胞中嗜碱性粒细胞Fig.5 Basophils negatively isolated from healthy controls

图6 RA患者来源的IgE对正常人来源的嗜碱性粒细胞的活化作用Fig.6 Role of IgE isolated from RA patients in activation of basophils negatively isolated from healthy controlsNote: The expression of CD203c (A) and proportion of IL-4 positive basophils (B) in different groups.*.P<0.05,**.P<0.01.

3 讨论

活化的嗜碱性粒细胞参与过敏性疾病的发展已被人们所知晓，其在过敏原的诱导下，活化的嗜碱性粒细胞释放大量的活性介质(组胺、白三烯、细胞因子等)，与此同时表面标志物CD203c和/或CD63表达上调[9]。研究显示CD203c不仅是嗜碱性粒细胞的一个特异性较强的标志物，而且也是一个敏感的活化指标[10]。嗜碱性粒细胞活化是多途径的，可以被细胞因子、蛋白酶、抗体、Toll样受体配体和补体介导的一系列信号所活化。当今研究者们也已达成共识，嗜碱性粒细胞是产生Th2细胞分化过程中必要的细胞因子IL-4的早期细胞，而IgE是介导其活化的主要途径[7,8]。已报道在自身免疫性疾病如SLE患者中嗜碱性粒细胞活化时，在外周血微环境诱导下可使其释放致病性炎症因子(IL-4、6、13等)，进而参与疾病的发生和发展[11]。本研究发现，RA患者外周嗜碱性粒细胞胞膜CD203c表达明显升高，处于高度活化状态，活化的嗜碱性粒细胞合成分泌IL-4增加，进而参与疾病的进展。

IgE是一类只存在于哺乳动物体内的经典免疫球蛋白亚型，在过敏疾病及自身免疫性疾病中具有重要作用。本研究发现RA患者外周血血清中存在高水平的IgE，而且总IgE水平与IL-4阳性嗜碱性粒细胞比例呈正相关。我们推测IgE可促进嗜碱性粒细胞的活化。为了验证该推测，我们将复选的高纯度嗜碱性粒细胞置于含或不含IgE的微环境中共培养，发现嗜碱性粒细胞在含IgE的微环境中的活化程度明显高于在不含IgE的微环境中。表明RA患者外周血中高水平的IgE可促进嗜碱性粒细胞的活化。这是因为嗜碱性粒细胞表面表达大量高亲和力IgE受体FcεRⅠα。嗜碱性粒细胞通过IgE高亲和力受体FcεRⅠ与IgE-抗原复合物交联，可激活一系列信号通路(信号分子Fyn、Syk、Lyn、PI3K及Akt等)，诱导嗜碱性粒细胞活化，释放炎性介质导致组织损伤[12]。同时，活化后的嗜碱性粒细胞表面的一系列膜分子表达上调(CD203c、CD63、CD11b、CD62L等)，进一步调节机体的免疫应答。

众所周知，RA患者血清总IgE包括游离的IgE和含IgE的免疫复合物(即与特异抗原结合形成的循环免疫复合物)。本研究用anti-IgE抗体刺激嗜碱性粒细胞，发现可以使其活化，并合成分泌IL-4。表明RA患者血清游离的IgE可以诱导嗜碱性粒细胞活化。此外，含IgE的免疫复合物也可能诱导嗜碱性粒细胞活化。一方面，RA外周血循环着大量自身反应性致病抗体(如类风湿性因子、抗瓜氨酸蛋白抗体等)，并以各种免疫复合物形式存在，而且其抗体滴度与疾病的活动性密切相关[13,14]。另一方面，研究也发现在RA患者体内存在IgE型免疫复合物，尤其是合并有重度关节炎及血管炎的患者[15-17]。此外，在RA血清中瓜氨酸化蛋白和IgE型抗瓜氨酸抗体IgE-ACPAs形成免疫复合物通过与FcεRⅠ受体交联活化嗜碱性粒细胞[18]。RA中虽然含IgE的免疫复合物也可诱导嗜碱粒细胞活化，但是，具体有哪些致病抗体与IgE形成免疫复合物，通过何种途径参与RA疾病的发病尚不清楚，有待深入研究。

综上，RA患者嗜碱性粒活化与发病相关，且主要由IgE介导，靶向嗜碱性粒细胞及其活化通路有望为RA的防治提供新的策略。

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[收稿2016-07-22]

(编辑 倪 鹏)

Mechanisms of peripheral basophils activation in patients with rheumatoid arthritis

LANQiao-Fen,LIAOHuan-Jin,CHENQiu-Hua,CAIJun,ZHANGLi-Fang,PENGYan-Xia,HEYi-Ming,WUPing,XIETong,PANQing-Jun.

ClinicalResearchCenter,AffilicatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,China

Objective:To investigate the activation of peripheral basophils from patients with rheumatoid arthritis (RA) and its mechanisms.Methods: The activation markers including CD203c and the proportion of IL-4 positive rate of peripheral basophils from RA patients and healthy controls were detected by flow cytometry.Serum levels of IgE in RA patients and healthy controls were detected by electrochemilu minescence immunoassay.Basophils were negatively isolated and co-cultured with or without purified IgE,anti-IgE as positive control,then,the expression of CD203c and propotion of IL-4 positive basophils were detected by flow cytometry.Results: The expression of CD203c and IL-4 positive rate of basophils from RA patients were higher than that of healthy controls (P<0.05).Serum levels of IgE in RA were higher than that of healthy controls (P<0.05).After co-cultured with isolated IgE from RA patients,basophils negatively isolated from healthy controls were activated,and higher expression of CD203c and proportion of IL-4 (P<0.05).Conclusion: Basophil activation is related with development of RA,and its activation is mainly mediated by IgE.Targeting basophil and its activation pathway would be expected to provide new strategies for the treatment of RA.

Rheumatoid arthritis;Basophil;Activation;IgE;IL-4

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.017

①本文为国家自然科学基金(No.81471530)和广东省自然科学基金(No.S2013010011568)。

兰巧芬(1991年-)，女，在读硕士，E-mail:18719097947@163.com。

及指导教师：谢 彤(1967年-)，男，硕士，主任医师，主要从事风湿免疫性疾病防治研究，E-mail:xt1234@163.com。 潘庆军(1978年-)，男，博士，副教授，主要从事自身免疫性疾病发病机制研究，E-mail:stilwapan@gmail.com。

R539.22

A

1000-484X(2017)01-0085-05

②共同第一作者。

③广东医学院附属医院风湿免疫科，湛江524001。

④广东医学院附属医院肾脏疾病研究所，湛江524001。