MTHFR基因及PAI-1基因多态性与复发性流产的相关性分析

詹乔乔，何莲芝

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001)

MTHFR基因及PAI-1基因多态性与复发性流产的相关性分析

詹乔乔，何莲芝

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 妇产科，安徽 芜湖 241001)

目的：探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T的多态性及纤溶酶原激活抑制物(PAI-1)基因4G/5G的多态性与复发性流产的相关性。方法:采用原位杂交荧光染色分析技术检测98例有生育史的健康妇女和120例习惯性流产女性的C677T基因型和4G/5G基因型。结果:C677T基因型包括CC、CT和TT。病例组TT型阳性率是34.2%。4G/5G基因型包括4G4G、4G5G和5G5G。病例组4G5G基因型阳性率是40.8%。结论:MTHFR基因C677T多态性及PAI-1基因4G/5G多态性与复发性流产密切相关。

MTHFR基因；PAI-1基因；复发性流产

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.01.011

习惯性流产(habitual abortion，HA)是指在20周之前自然流产2次或2次以上者,也为复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)，是影响生育年龄夫妻的一个重要的临床问题[1]。RSA使生育年龄夫妻承受着巨大的社会及心理压力[2-3]，可能引起离婚及一系列的社会问题。妊娠期发生流产1次的概率为15%～20%，1%～5%的孕妇出现RSA。由于一些女性在意识到自己怀孕前就发生流产，复发性流产的概率比实际报道的要高。除了已知的自身免疫因素、生殖系统畸形、双方染色体异常、男性精液异常等因素，其中40%～55%的RSA目前尚无明确病因[4]。近年来，RSA患者呈上升趋势，本研究的目的就在于发现不明原因复发性流产与亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因C677T多态性及纤溶酶原激活抑制物(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)基因4G/5G多态性的关系，为临床RSA的发生提供基础理论研究依据，将来预测及预防RSA的发生。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015年3月～2016年3月弋矶山医院妇科门诊、妇产科住院部及生殖医学中心就诊的120例习惯性流产患者作为病例组，平均年龄(29.2±5.5)岁(23～37岁)，同期选取我院妇科住院部98例有正常生育史的健康女性为对照组，平均年龄(27.4±6.8)岁(22～38岁)。所有研究对象均为随机选择，且签署知情同意书并得到医院道德伦理委员会的批准。

1.2 纳入及排除标准 ①全部研究对象均排除内科及内分泌系统疾病；②流产原因明确与女性生殖系统畸形无关(如子宫过小、宫腔粘连、鞍状子宫等子宫发育异常)；③怀孕期间无大量饮用酒精类饮品、含咖啡因类食品、剧烈运动等严重不良嗜好、不良生活习惯等；④男方精液常规及夫妻双方染色体等无异常；⑤TORCH(-)、生殖抗体检测等无异常。

1.3 方法

1.3.1 血标本 采集患者外周静脉血2～3 mL装于乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)抗凝采血真空管中。

1.3.2 实验试剂及器材 L998A荧光检测仪购买自西安天隆科技有限公司；微型高速离心机购买自杭州奥盛仪器有限公司；氯化铵溶液购买自北京华夏时代基因科技发展有限公司；PHARM-GENE01SNP分析保存液购买自北京华夏时代基因科技发展有限公司，主要成分：50 μL 60%聚乙二醇200，40 μL氢氧化钾(终浓度20 mmol/L)和去离子水；PHARM-GENE200SNP分析样品处理试剂购买自北京华夏时代基因科技发展有限公司，15 μL主要成分：1 μL Tris.HCl(终浓度20 mmol/L)，3 μL KCl(终浓度50 mmol/L)，3 μL MgCl2(终浓度1.5 mmol/L),1 μL 0.1%吐温20，2 μL 0.01%BSA,1.5 μL H3PO4(终浓度5 mmol/L),Oligonucleotides,KOD,1 μL dNTPs(终浓度200 μmol/L)。

1.3.3 实验方法 氯化铵溶液与灭菌注射用水按照1∶9比例稀释作为工作液；在1.5 mL离心管中加入1mL工作液，取150 μL混匀的待检血液标本加入离心管中，颠倒混匀，室温静置5 min；样本放入离心机，3000 r/min离心5 min；取出离心管，吸去上清，在离心管底部获得富集的白细胞沉淀；在离心管中加入100 μL耀金保，反复吹打混匀，室温下静置30 min，得到白细胞保存液；吸取1.5 μL白细胞保存液加入相应耀金分中，完成后盖紧管盖，置入荧光检测仪；采用荧光染色原位杂交及染色体核型分析系统自动判读荧光信号值，获取荧光曲线图，进行MTHFR677C>T，PAI14G5G基因分型，并作阳性质控[5]。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS 18.0 进行统计学分析。两组基因型频数比较采用χ2检验；两组纯合子及杂合子基因型、等位基因频数之间的比较采用χ2检验、OR及CI。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组MTHFR基因型频率及等位基因频率分析 复发性流产组MTHFR基因C677T突变基因型明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中TT基因型频率(34.2%)高于对照组(11.2%)，TT与CC基因型频率比较(χ2=23.789,P<0.05，OR=6.613,95%CI:2.978～14.681)差异有统计学意义。CT基因频率(40%)高于对照组(32.7%)，差异有统计学意义(P<0.05)。CT与CC基因型频率比较差异有统计学意义(χ2=9.534,P=0.010，OR=2.661,95%CI:1.421～4.985)。复发性流产组总突变T等位基因频率(54.2%)高于正常对照组(27.6%)，差异有统计学意义(χ2=31.334,P<0.05,OR=3.108,95%CI:2.076～4.652)，详见表1、2。

表1 两组C677T和4G/5G基因型频率分布n(%)

分组C677T基因型CCCTTTPAI-1基因型5G5G4G5G4G4G病例组31(25.8)48(40.0)41(34.2)30(25.0)49(40.8)41(34.2)对照组55(56.1)32(32.7)11(11.2)45(45.9)23(23.5)30(30.6)χ2值25.24228.028P值<0.01<0.01

表2 两组C677T和4G/5G等位基因频率分布n(%)

分组C677T等位基因CT4G/5G等位基因4G5G病例组110(45.8)130(54.2)109(45.4)131(54.6)对照组142(72.4)54(27.6)113(57.7)83(42.3)χ2值31.3346.464P值<0.01<0.05OR3.1081.636CI2.076～4.6521.118～2.394

2.2 两组PAI-1基因型频率及等位基因频率分析 复发性流产组PAI-1基因4G/5G突变基因型高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中4G4G基因型频率(34.2%)高于对照组(30.6%)，G4G与5G5G基因型频率比较差异有统计学意义(χ2=4.598,P=0.032，OR=2.050,95%CI:1.060～3.965)；4G5G基因型频率(40.8%)高于对照组(23.5%)，4G5G与5G5G基因型频率比较差异有统计学意义(χ2=11.631,P=0.010，OR=3.196,95%CI:1.623～6.291),复发性流产组总突变4G等位基因频率(54.6%)高于正常对照组(42.3%)，差异有统计学意义(χ2=6.646,P=0.011,OR=1.636,95%CI:1.118～2.394)。详细见表1、2。

3 讨论

尽管已有文献报道MTHFR基因有几个突变位点，但C677T和A1298C突变仍是其最常见的突变[6]。MTHFR是机体代谢过程中的一个关键酶，可将同型半胱氨酸转变成蛋氨酸，S-腺苷蛋氨酸是DNA甲基化的重要的甲基供体[7]。而DNA甲基化则在基因表达过程中扮演重要角色。当该酶活性异常时，可影响血管形成及胚胎的生长发育。已有报道指出，在正常怀孕前三个月胚胎处于低同型半胱氨酸及高叶酸、高蛋氨酸的状态。MTHFR的催化作用可使5,10-亚甲基四氢叶酸还原成5-甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸再催化高同型半胱氨酸成蛋氨酸。MTHFR基因C677T多态性可影响酶的活性，CT型携带者较CC型有65%的酶活性，而TT基因型携带者较CC型只有30%的酶活性。有学者[8]对2427例复发性流产患者组及3118例正常组的对比研究中发现TT基因纯合子患者可增加RSA的风险，但对于3次及3次以上复发性流产患者，除了TT型纯合子携带者可增加流产率，CT+CC型与流产率无明显关系。Nair[9]研究发现T等位基因与不明原因复发性流产的关系显著。有资料显示，高同型半胱氨酸对胚胎的毒性作用远大于其对细胞甲基化的影响，而且高半胱氨酸通过循环单核细胞诱导组织因子的表达导致血栓的形成，引发体内的凝血机制，进而引起胎盘血栓栓塞导致流产。并且，高同型半胱氨酸通过促进白细胞聚集影响内皮细胞的作用，使机体处于高氧化应激状态，影响RSA患者的妊娠结局。金华[10]对84例不良妊娠结局的妇女的研究也发现，较C677T 的CC 型相比，CT 型、TT 型和CT + TT 型会增加发生不良妊娠的风险。本研究同样支持该论点，CT型及TT型患者较正常对照组妇女发生习惯性流产的几率分别增加1.5倍及4倍。

怀孕期间是一个高凝状态，但如果怀孕被血栓形成所影响，则怀孕的高凝状态越发严重，而且可能损害静脉的血液流动，导致深静脉血栓形成、胎盘血栓形成，引起胎儿生长受限或者胎儿死亡，最终引发流产。由于血栓形成对复发性流产的影响，抗凝剂用于治疗复发性流产越来越广泛。纤溶酶原激活物属于丝氨酸蛋白酶，在酶级联反应中将血纤溶酶原催化成纤溶酶。PAI-1位于7号染色体的长臂，由8个内含子及9个外显子组成，其是在滋养层入侵，是孕产妇组织重构过程中控制蛋白质水解的关键酶。当该基因位点突变时，纤溶酶原激活物(PA)与PAI的动态平衡即被打破，PAI-1 通过与 PA结合形成稳定、没有活性的复合物，高浓度的PAI-1通过纤维蛋白溶解凝固而导致血栓形成[11-12]，可引起胎盘损害和血栓并发症的形成[13]。PAI-1基因启动区域4G等位基因的纯合型和PAI-1基因的转录有关，其可增加该基因的表达。4G4G纯合子基因携带者体内PAI-1浓度最高，4G5G杂合子基因携带者次之，5G5G型体内PAI-1浓度最低。Patil[14]发现PAI-1 4G/5G纯合子突变与复发性流产相关性最高，王晓慧[15]发现4G/5G多态性与RSA的风险增加有关，其中4G突变是引发RSA的主导因素。本实验结果也发现4G4G型及4G5G型携带者发生习惯性流产的概率均高于正常对照组，更加支持4G突变是不明原因RSA的高危因素之一。

对于不明原因复发性流产基因多态性的研究分析应在不同地域、不同种族、不同人群中展开全面调查，这些研究结果可以帮助临床医生制定更好的治疗策略。本文研究中发现MTHFR T等位基因及PAI-1 4G等位基因在复发性流产的患者中突变率较高，提示这两种突变等位基因是不明原因复发性流产的潜在危险因素之一。那么在怀孕前期及怀孕早期是否可以适当服用叶酸及阿司匹林来预防血栓形成的可能性，降低因MTHFR基因及PAI-1基因位点突变引发流产的风险，这一观点仍然需要大量的临床试验研究来证实。

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Correlation analysis of MTHFR and PAI-1 polymorphisms with recurrent spontaneousabortion

ZHAN Qiaoqiao,HE Lianzhi

Department of Gynecology & Obstetrices，The first Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Objective：To investigate the association of MTHFR gene C677T and plasminogen activator inhibitor type 1(PAI-1)gene 4G/5G polymorphisms with recurrent spontaneous abortion.Methods:Fluorescence in situ hybridization(FISH)was used to detect the C677T and 4G/5G genotypes in 98 healthy women with fertility history and 120 women with recurrent spontaneous abortion.Results:Variant genotype of C677T consisted of CC,CT and TT and 4G/5G included 4G4G,4G5G and 5G5G.The positive rate for TT was 34.2% and for 4G5G,40.8%,respectively,in women with recurrent spontaneous abortion.Conclusion:MTHFR gene C677T and PAI-1 4G/ 5G polymorphisms are strongly associated with recurrent spontaneous abortion.

MTHFR gene；PAI-1 gene；recurrent spontaneous abortion

1002-0217(2017)01-0038-04

2016-04-27

詹乔乔(1991-)，女，2014级硕士研究生，(电话)15805535046，(电子信箱)690124059@qq.com； 何莲芝，女，主任医师，硕士生导师，(电子信箱)429094335@qq.com，通信作者。

R 714.21

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