2种木霉菌对杨树叶枯病致病菌的抑菌活性研究

梁丹，沈威，刘璐，杨子健，先文娟，殷娇,熊静

(辽宁省林业调查规划院，辽宁 沈阳 110000)

2种木霉菌对杨树叶枯病致病菌的抑菌活性研究

梁丹，沈威，刘璐，杨子健，先文娟，殷娇,熊静

(辽宁省林业调查规划院，辽宁 沈阳 110000)

杨树叶枯病〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl〕分布广泛，是杨树主要病害之一。目前针对杨树叶枯病主要是化学防治为主，大量使用杀菌剂污染环境，同时促使该地区抗性种群的形成。木霉菌是一种资源丰富的拮抗微生物，已作为生物制剂应用于一些树种的病害防治。文章以生防菌绿色木霉菌(Trichodermaviride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)为试材，研究2种木霉菌株对杨树叶枯病病原菌株生长的拮抗作用，及其对杨树叶枯病菌株生长的抑制作用，以期为利用木霉菌有效防治杨树叶枯病提供理论依据。

杨树叶枯病；哈茨木霉；绿色木霉

杨树叶枯病是由半知菌亚门的链格孢菌〔Alternariaalternata(Fr.) Keissl〕引起的一种杨树叶部病害，它既能危害插条苗，又会感染实生苗，发病最重者整株叶片全部枯死。[1]该病从杨树叶片抽生开始，危害杨树叶片、嫩梢和幼茎，5—6月染病最重，受害的叶片会出现近圆形、多角形或不规则形的病斑，直径可达1～5 mm，病斑多时可连成大斑，病斑上有黑色霉状物，嫩梢和嫩茎上的病斑凹陷，呈菱形，上有绿色霉层。[2]该病原菌寄生性不强，但寄主范围很广，常发生在农作物、经济作物、果树、蔬菜及杂草上，近年来又在用材林树种及绿化树种上发现，受害地区广泛，主要集中在我国东北、西北、华北地区。而用材林上细链格孢菌，最早发现于一些杨树杂交品种的叶部，形成大量的坏死型病斑，造成叶枯，提早落叶。杨树叶枯病可危害毛白杨、小叶杨、小青杨、银白杨、北京杨等多种杨树，对杨树苗木及幼林造成严重危害：如近几年发生在北京市东北旺苗圃的毛白杨连年受此病的危害，1981年叶片感病率达100%，叶片大量提前脱落，四川省天全县杨树苗圃2000年感病率达85%以上，同时在黑龙江省也曾大面积发生，导致很多苗圃的苗木死亡，给林业生产造成了很大的经济损失，已成为影响当地杨树优质高产的主要因素之一，找到治疗之法已刻不容缓。

目前，由于化学杀菌剂对环境、人体带来的副作用以及病原菌日益明显的抗药性，新的治疗方法的出台势在必行，利用木霉菌作为生物杀菌剂的研究引起了世界各国的广泛兴趣。木霉菌(Trichodermaviride)是自然界中普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物，常见于植物残体及动物粪便上，从植物的根围及种子、球茎表面即可分离到，具有广泛适应性、产生拮抗物的多样性、寄生的广谱性和对环境影响小等特点，成为最有希望的生防因子。该菌是重要的植物真菌病原菌的抑制菌，具有较强的适应性，通过营养争夺、重寄生、产生抗性物质或溶解酶类可以抑制许多病原菌，因此深入研究、开发和生产优良木霉菌，对于防治植物真菌病害，促进生产具有重要意义。在木霉菌的种群中有一大类被称为拮抗(T.viride)。钩状木霉(T.hamatum)、长枝木霉(T.longibrachiatum)、康氏木霉(T.koningii)以及新近归为粘帚霉属的绿粘帚霉(Gliocladiumvirenstrichodermavirens) 都属于拮抗类， 但目前农业生防上商业化的产品主要是哈茨木霉菌株及少量的绿色木霉菌株，它们在植病生防中正日益受到重视，应用技术也不断突破。多年来，人们对木霉菌的生防应用、生物药剂的开发以及生防机制做了很多尝试和深入研究。国内外许多学者将其用于防治水稻纹枯病，现在，木霉还可以用于叶面、花器和果实的保护：在葡萄园内用绿色木霉的孢子液于始花期至收获期喷施，可以降低灰霉引起的藤蔓腐烂以及果实在储藏期的腐烂，有效地防治灰霉病。在杨树烂皮病的生防研究中发现：木霉对烂皮病菌也有较好的防治效果，林间防治杨树烂皮病治愈率达92.4%，预防效果达82.4%。[3]茆振川报道了木霉菌对苹果轮纹病的抑制作用，[4]而且国外已有商品化的木霉制剂问世，如美国的Topshield(哈茨木霉T-22菌株)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39菌株)；同时在国内，也已经有关于其防治白涓病、猝倒病、灰霉病等的报道。木霉的拮抗机制也是多样性的，一般有竞争作用、抗生作用、重寄生作用等。据不完全资料统计，木霉至少对18个属29种病原真菌在体外或体内表现有拮抗作用。目前叶枯病的防治，在很大程度上还是依赖于化学防治，一般从发病开始在整个生长季节喷洒2～3次的40%的乙膦铝300倍液，或75%百菌清500倍液，或50%的多菌灵1 000倍液防治，并通过及时清理枯枝落叶带出林外集中烧毁或埋沤制肥的方法减少病源，从而减少发病率。利用化学方法防治杨树叶枯病时，化学药物在抑制病原菌的同时也将杀死树体上有益的拮抗微生物，同时也会使病原菌产生抗药性并污染环境。在可持续发展呼声越来越高的今天，化学公害越来越严重，木霉作为一类资源丰富的拮抗微生物，在植物病害生物防治中扮演着越来越重要的角色；同时，随着现代生物技术的不断发展，木霉的生防效果和稳定性有了显著的提高，并展示出广阔的应用前景；这些为木霉菌对杨树叶枯病的抑制作用提出了可能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

病原菌：病株取样杨叶枯病病菌

生防菌：绿色木霉、哈茨木霉

1.1.2 培养基的制备

试验所用培养基均采用PDA培养基。

配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钠3 g，琼脂20 g，水1 000mL；

将洗净后带皮的马铃薯切碎，加入定量的水煮沸30 min，用纱布滤出马铃薯残渣，加入琼脂，加热使琼脂完全融化，再加入糖，并补入适量的水，使最后的总量仍然为原量。分装在试管和三角瓶中，然后灭菌备用。

1.2 病原菌的鉴别

1.2.1 症状观察 选取具有典型杨树叶枯病症状的杨树叶片观察，其症状如下：初期，感病叶片上产生隐约可见的褐色斑，以后病斑逐渐扩大。病斑黄色，中央褐色。后期，病斑上产生黑褐色霉状物，为病原菌的分生孢子梗和分生孢子。病斑可相互连成大斑，全叶枯死。

1.2.2 病原菌观察及鉴定 选取具有典型症状的杨树叶片病部，进行镜检。直接用针挑取少许菌丝体，放在加有水滴的载玻片上，加盖玻片后在显微镜下镜检。

1.3 病原菌的分离和纯化

1.3.1 杨树叶枯病病原菌的分离 选择新发病的植株器官或组织作为分理材料然后进行组织表面消毒，消毒时先用70%酒精浸泡病组织2～3 s，赶走病组织表面气泡，然后用次氯酸钠消毒，消毒后用灭菌水冲洗2～3次。

次氯酸钠消毒液配方30%(现配现用)：次氯酸钠(NaClO3)，30 g；水，100 mL。

取杨树叶枯病的病叶，直接用移植钩挑取菌株的菌丝，接种于PDA平板中央，于25 ℃恒温箱中培养3d。3d之后，观察各菌落形态，直接用针挑取少许的菌组织放在加有水滴的载玻片上，加盖玻片后在显微镜下检视，根据菌落形态，确定病原菌。

1.3.2 杨树叶枯病病原菌的纯化 采用微块单孢分离法，挑取供纯化菌种的孢子少许加于试管内的无菌水中，摇动混合1～2 min使孢子充分散开。调节孢子浓度到10倍视野中2～5个孢子。取此孢子悬浮液2～3 mL倒入4%水洋菜平板表面，轻轻左右摇动培养皿使孢子液均匀展布于培养基表面静置5 min，使大部分孢子沉淀，然后倾斜培养皿，用吸管吸去多余的孢子液。用灭菌刀将带有分散孢子的水洋菜平板切成0.3 cm×0.3 cm小块，移至载玻片上检查。逐个检查，见有单个孢子的微块，随即用移植铲移入PDA培养基中培养，每皿可放4～5块[16]。

1.4 试验方法

在直径9cm培养皿的PDA平板培养基上，相距3 cm分别接入直径0.6 cm培养5d的近乎同质、等量的杨树叶枯病病原真菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。对照则在平板中心各接人直径0.6 cm 的杨叶枯病病原菌和木霉菌(Trichodermaspp．)。每个处理设置5个重复，置于生化培养箱中，用散射光、25 ℃培养。每12 h测量菌落的半径，连续观察3 d。

拮抗结果计算时，采用两菌落相向半径进行拮抗生长测定。

由于拮抗真菌抑制病原真菌的同时，其本身也被病原真菌所抑制，因此在计算拮抗效果时，采用相对抑菌效果，即拮抗真菌被抑制1%个单位所产生的效果。被抑制率与相对抑菌效果的计算[17]如下：

被抑制率=〔(单独培养菌落半径)-(菌落趋向半径)〕/(单独培养菌落半径)×100%；

相对抑菌效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率。

2 结果与分析

2.1 3种真菌单独培养

表1 3种真菌单独培养时菌落半径的增长情况

注：Al—Alternariaalternate(Fr.) Keissl；Tv—Trichodermaviride；Th—Trichodermaharzianum

由表1数据作曲线图得到图1。

由表1和图1我们可以看出，3种真菌单独培养时，无论何时测量2种木霉菌的生长半径都明显大于病原菌的生长半径，未达到72h时，2种木霉菌都已长满皿，说明2种木霉菌的生长速度大于病原菌，在营养争夺上木霉菌生长速度快可能会占有优势；2种木霉菌相比较，Th的生长速度快于Tv。

图1 3种真菌单独培养菌落生长情况

2.2 绿色木霉(T. viride)与病原菌拮抗培养

T.viride菌株与病原菌的对峙培养结果见表2。

表2 T. viride菌株与病原菌的对峙培养结果

由表2中数据可以看出木霉菌(T.viride)的相对半径在不断增大，杨树叶枯病病原菌的相对半径先增大，在48 h时增加到最大值0.69 cm，后在绿色木霉菌的作用下菌落半径逐渐减小。

T.viride与病原菌菌株的拮抗效果见表3。

表3 T. viride菌株与病原菌对峙培养的拮抗效果

由表3可以看出，木霉菌(T.viride)在拮抗培养过程中的被抑制率从12 h到24 h先是增加到最大值12.03%，然后从24 h到48 h时在减小到最小值2.91%，从48 h到60 h时又增大；病原菌的被抑制率在相对培养过程中一直在增加，当72 h时达到最大为64.52%；相对抑制效果在12 h到24 h时先减少到最小值1.66，从24 h到48 h不断增大，48 h时达到最大值13.38，从48 h到60 h又减小。

2.3 哈茨木霉(T.harzianum)与病原菌拮抗培养

T.harzianum菌株与病原菌的对峙培养结果见表4。

表4 T.harzianum菌株与病原菌的对峙培养结果

由表4可以看出木霉菌T.harzianum的相对生长半径不断增大；病原菌的相对半径从12 h到60 h一直在增大，但在60 h到72 h时相对半径减小。

病原菌分别与T.harzianum菌株的拮抗效果见表5。

表5 T.harzianum菌株与病原菌对峙培养的拮抗效果

由表5可以看出木霉菌(T.harzianum)在拮抗培养过程中被抑制率不断增大，最大被抑制率为46.35%；病原菌在拮抗培养过程中被抑制率也不断增长，最大抑制率为61.29%；相对抑制效果12 h最大为4.33，随后不断减小，最小值为0.62，到60 h时又增大为0.98。

3 结论与讨论

3.1 结论

通过上述对杨树叶枯病病原菌链格孢菌的鉴别、分离、纯化培养以及其与绿色木霉、哈茨木霉对峙培养试验初步得出以下结论：

供试的两种木霉菌Tv和Th菌株对杨树叶枯病有一定的空间和营养竞争作用，对其病原菌的生长都有一定的抑制作用。两种木霉菌在生长速度上与病原菌相比有一定的优势，因此可较快的争夺营养与空间；至72h，病原菌被Trichoderma的抑制率由高至低分别达到：Trichodermaviride为64.52%：Trichodermaharzianum为61.29%。而相对抑制效果由高至低为：Trichodermaviride、Trichodermaharzianum；其相对抑制效果最高分别达到13.38和4.33，因此可得出抑制效果最佳菌株为Trichodermaviride。

3.2 讨论

杨树叶枯病是一种由链格孢菌引起的叶部病害，防治其发生的关键是防治链格孢菌生长。因此，通过绿色木霉菌、哈茨木霉菌分别与杨树叶枯病链格孢菌进行拮抗试验，分别计算出抑制率与相对抑制效果，从而找出对杨树叶枯病具有较好抑制作用的木霉菌株，本文认为相对抑制效果较高的为绿色木霉菌，但是由于本试验只是从抑制率和相对抑制效果的角度进行说明，有一定的局限性，因此还需要从生理和分子生物学的方面进行深入研究。

木霉菌作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物，在植物生防中具有不可替代的地位。木霉菌对病原菌的拮抗作用具有广谱性的特点，但不同种，同种的不同菌株都存在着拮抗作用的差异。国内对木霉菌生物防治方面的研究还局限于木霉菌对植物病原菌拮抗机理的初步分析，拮抗菌株的筛选，发酵条件的优化等，主要剂型为粉剂和可湿性粉剂。国内登记生产木霉菌制剂的企业虽然较少，但木霉菌制剂在市场上的销售增长较为迅速，目前为止，木霉菌生防制剂已占据了真菌杀菌剂近一半的市场份额。国外木霉菌相关的研究与应用起步比较早，发展非常迅速，已有多种登记注册的产品，例如木霉菌 T22 和 T39。国外对木霉菌生防作用机制的研究也较为深入，不仅在木霉菌发酵过程控制方面具有先进的经验和设备，并且对木霉菌所产生的具有生物防治活性的代谢产物的种类、化学结构及作用机理等方面也进行了较为详细的研究。特别是近几年，国外利用一些新的方法如蛋白质组学分析和基因报告系统等，研究植物、病原菌及木霉菌三方互作的关系。通过基因表达的差异分析进一步了解木霉菌生防作用的机理，从而为开发木霉菌新的生物防治技术提供理论支持。然而相关的研究在国内还未引起足够的重视。

近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速的发展。结合遗传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产量，以及增强对病害的防御性方面势必有更为广阔的应用前景。特别是在倡导绿色农业的大背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。

[1] 徐素琴.链格孢菌引起的林木病害及防治措施[J].林业科技， 1986(5)

[2] 孙仲平，马文海，王占斌. 杨叶枯病病原菌生物学特性初步研究[J]. 中国森林病虫，2007，26(1):4-7[3] 高克祥，刘小光 ，郭润芳，等. 木霉菌对杨树树皮溃疡病菌拮抗作用的研究[J].林业科学， 2001，37(5):82-86

[4] 肖烨，易图永，魏林，等. 木霉菌对几种植物病原菌的拮抗作用[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2007，33(1):72-75

[5] 赵蕾 .木霉菌的生物防治作用及其应用[J].中国生态农业学报，1999(1)

[6] 杨依军，王勇， 杨秀荣，等.拮抗木霉菌在生物防治中的作用[J].天津农业科学， 2000，6(3): 29-32

[7] 郭润芳，史宝胜，高宝嘉，等．木霉菌在植病生物防治中的应用[J]．河北林果研究，2001，16(3)：294-298

[8] 惠有为，孙勇，潘亚妮，等.木霉在植物真菌病害防治上的应用http://www.cnki.com.cn/Article/CJFD2003-XBNX200303028.htm[J].西北农业学报，2003(1): 100-103

[9] Lorito M ， Hayes C K， Pitro D A ， et al . Purification characterization and synergistic activity of a glucan 1， 3-β-glucosidase and an N -acetyl-β-gluco saminidase fromTrichodermaHarzianum[J]. Phytopatholgy， 1994，84: 398-405

[10] Bhuyan S A. Journal of the Agricultural Science Society of North East India [J]. 1994，7(1):125-127

[11] 项存悌， 高克祥. 东北林业大学学报[J]，1991，19(6):15-25

[12] 茆振川.木霉菌对侵染苹果枝条的轮纹病的抑制作用 [J].落叶果树，1996(3):6-8

[13] 杨雨环，燕嗣皇，陆德清，等.木霉防治辣椒白绢病和猝倒病试验研究[J].贵州农业科学，1996(2):31-34

[14] 徐 同， 钟静萍. 木霉对土传病原真菌的拮抗作用 [J]. 植物病理学报， 1993，23(1): 63-67

[15] 李立平，段德芳. 木霉生物学特性及拮抗作用研究进展[J].植物医生，2006，19(4):4-6

[16] 宋瑞清， 张新玉. 白桦外生菌根菌培养特性及生理学习性[J]. 东北林业大学学报，2003， 31(4)

[17] 宋瑞清，周秀华.Trichoderma spp.对樟子松枯梢病病原菌的影响[J].东北林业大学学报，2004，32(4)：29-30

[18] 王海云.丰产杨树的培育[J].湖南林业，2004(11):22

Antimicrobial Activity of Two Kinds of Trichoderma to Pathogen of Leaf Blight from Poplar Trees

Liang Dan, Shen Wei, Liu Lu, Yang Zijian, Xian Wenjuan, Yin Jiao,Xiong Jing

(Liaoning Provincial Forestry Investigation and Planning Institute,Shenyang,110000,China)

Leaf blight from the poplar trees is widely distributed, which is one of the main diseases of poplar. Currently, it is mainly chemical control of poplar leaf blight, polluting the environment with fungicide, Formation of Resistant Populations. Trichoderma is a resource-rich antagonistic microorganisms and has been used as a biological agent in disease prevention and control of some tree species. In this paper,TrichodermavirideandTrichodermaharzianumwere used to study the antagonistic effect of twoTrichodermastrains on the growth of leaf blight of poplar and the effects ofTrichodermaviride, Growth inhibition, with a view to the use ofTrichodermaeffective control of poplar blight provide a theoretical basis.

Poplar leaf blight;Trichodermaharzianum;Trichodermaviride

1005-5215(2017)01-0028-04

2016-12-06

梁丹(1990-)，女，辽宁沈阳人，大学，助理工程师，现从事林业调查规划工作.

S435.121.48

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.01.008