番茄青枯病病原菌拮抗菌株的筛选及其田间防控作用研究

王丽丽, 周旭东, 李国安, 姚红燕, 汪 峰

(1.宁波市农业科学研究院,宁波 315040; 2.宁波致富宝生物科技有限公司,宁波 315324)

番茄青枯病病原菌拮抗菌株的筛选及其田间防控作用研究

王丽丽1, 周旭东2, 李国安1, 姚红燕1, 汪 峰1

(1.宁波市农业科学研究院,宁波 315040; 2.宁波致富宝生物科技有限公司,宁波 315324)

从番茄青枯病发病严重田块的健康植株根际土壤中分离筛选得到2株高效拮抗菌株,命名为W12和W118,经16S rDNA基因鉴定均属芽胞杆菌属;用PCR扩增的方法扩增脂肽类抗生素合成基因,结果表明W12和W118含有合成bacillomycin、iturin和fengycin三种抗生素的基因;将2株拮抗菌用于田间试验,结果表明混合菌株防控效果最好,3次灌菌后防控效果达到62.3%,单独施用菌株W118较单独施用W12防控效果好,3次灌菌后防控效果达到56.7%。

番茄青枯病; 拮抗菌; 抗生素合成基因

青枯病是一种灭绝性的土传细菌病害,它是由茄科劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum入侵植株根部组织而引起的,其大规模分布于热带、亚热带以及温带地区,在我国南方地区番茄上最为流行[1-2]。该病可造成被侵染作物大面积萎蔫直至死亡,发病严重的田块青枯病的发病率高达80%以上,使得番茄产量急剧下降,严重制约了我国南方地区番茄产业的发展。

目前防控番茄青枯病常用的方法主要有:施用化学农药、利用土壤改良剂、选育具有抗病性能的品种、嫁接及与禾本科作物轮作等,但效果均不稳定[3-4]。此外,施用化学农药还会引起一系列的环境污染和食品安全问题。因此生物防治将会是一条环保、经济、有效的防控途径。

番茄青枯病的生物防治主要是应用拮抗微生物及其代谢产物来控制病原菌。从土壤中分离筛选到高效拮抗病原微生物的拮抗菌是生物防治成功的前提。芽胞杆菌产生的芽孢具有耐高温性,而且还能在辐射、高酸碱等逆境下存活,因此,筛选出高效拮抗芽胞杆菌备受重视。丁传雨等[5]用筛选得到的2株芽胞杆菌的菌液防控马铃薯青枯病,防控效果分别为85.1%和82.1%。郑新艳等[6]用筛选得到的拮抗菌株防控马铃薯青枯病,发现其不但能够有效拮抗青枯菌,还能提高马铃薯根系土壤微生物的多样性,有助于克服土壤连作障碍。本试验筛选和分离得到2株抑制番茄青枯病菌的高效芽胞杆菌菌株,并对其进行了分子鉴定和拮抗基因的扩增,检测了拮抗菌的田间效果,旨在为番茄青枯病的生物防治工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤

分别从宁波奉化、鄞州、江北、宁海、余姚、慈溪等青枯病发病严重地块采集健康植株根际土壤35份。将植株连同根系一起连根拔起,轻轻地抖动,待植株根部大部分土壤被抖落后,将剩下紧贴根部的土壤连同须根一起收集起来,用自封袋装好,放入4℃冰箱保存。

1.1.2 供试菌株和培养基

青枯病菌菌株为由本实验室筛选、鉴定、保存的一株茄科劳尔氏菌。

牛肉膏蛋白胨改良培养基(NA):每1 000 mL培养基中加葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏3 g,琼脂粉15 g,pH 7.0。

1.2 拮抗菌株的分离、筛选

10 g健康番茄植株根际土壤投入装有90 mL ddH2O的锥形瓶中,在30℃摇床上剧烈振荡30 min,静置30 min。取上清液系列稀释涂布于改良牛肉膏蛋白胨培养基上,每个梯度设置3次重复,放置于30℃恒温培养箱内培养24 h后,用喉头喷雾器将浓度为1.0×108cfu/mL青枯菌菌悬液喷于其表面,待平板上显现明显的抑菌圈后,用接种针选取有抑菌圈,且形态不同的菌落,在新的平板上进行画线纯化。

在改良牛肉膏蛋白胨培养基上用灭菌牙签接种纯化后的菌株,放置于30℃恒温培养箱内培养12 h,将1.0×108cfu/mL的青枯病菌菌液均匀喷洒于平板上,48 h后测定抑菌圈直径,每个菌株设置3次重复,选择抑菌圈大于15 mm的菌株保存备用。

1.3 菌株16S rDNA鉴定

用市售细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌株W12和W118的基因组DNA,采用细菌16S rDNA 基因的通用引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和3′-TACCTTGTTACGACTT-5′进行PCR扩增。反应程序设置如下:94℃ 5 min;94℃ 60 s,53℃60 s,72℃ 2 min,设置35个循环;72℃ 7 min;4℃保持10 min。PCR反应后的凝胶产物经试剂盒回收纯化后进行测序分析,测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.4 拮抗菌株基因组DNA中脂肽类抗生素合成基因的PCR检测

采用PCR法检测拮抗菌株基因组DNA中编码脂肽类抗生素合成的基因。检测的抗生素基因名称、引物及其片段大小详见表1。PCR反应体系如下:10×Taqbuffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+1.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL,25 pmol/μL上下游引物各2 μL,细菌基因组DNA 1 μL, 5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.5 μL,ddH2O 14 μL,总体积25 μL。反应程序:95℃ 5 min;95℃ 60 s, 55℃ 30 s, 72℃ 105 s, 35个循环；72℃ 10 min, 4℃保持10 min。

1.5 田间试验设计

田间试验在宁波市鄞州区横溪基地内进行。以1.2小节筛选出的拮抗效果较好的菌株为供试菌株,菌株发酵液浓度为108cfu/mL。于番茄移栽后1个月(幼苗期)开始施用拮抗菌株发酵液,每隔7 d施用1次,共计4次。每株番茄苗浇灌10 mL,其中混合菌浇灌总共为10 mL。每个处理3次重复,以施用等量清水为对照。

1.6 病情调查

试验开始前调查并记录各处理番茄植株的发病情况,选择病情大致相同的区域进行试验,之后每次灌菌后统计各处理的病情指数和防控效果。根据植株叶片萎蔫程度,将发病级别分5级[7]:0级,植株正常;1级,植株叶片萎蔫程度不超过25%;2级,植株叶片萎蔫程度超过25%且不超过50%;3级,植株叶片萎蔫程度超过50%且不超过75%;4级,植株叶片萎蔫程度超过75%。

表1 基因名称及引物序列

Table1 Name of gene and primer sequence

基因名称Nameofgene拮抗物质Antibiotics引物名称Primer引物序列(5'-3')Primersequence片段大小/bpLengthfenBfengycinFenB(正向)CTATAGTTTGTTGACGGGCTC1400FenB(反向)CAGCACTGGTTCTTGTCGCAituAiturinItuA(正向)ATGTATACCAGTCAATTCC1100ItuA(反向)GATCCGAAGCTGACAATAGituBiturinItuB(正向)TAAAGCAGCGGATAAAGCGT 874ItuB(反向)AATGGCGACTAACGTATCGGituCiturinItuC(正向)CCGTAATCAACCGTCTCGTT 640ItuC(反向)GGGTGAGCTGCAAACTTCTCituDiturinItuD(正向)GATGCGATCTCCTTGGATGT 647ItuD(反向)ATCGTCATGTGCTGCTTGAGbambacillomycinBam(正向)AAGAAGGCGTTTTTCAAGCA 508Bam(反向)CGACATACAGTTCTCCCGGT

病情指数=∑(病级数×该病级植株数)/

(最大病级数×植株总株数)×100;

防控效果(%)=(对照组病情指数-

处理组病情指数)/对照组病情指数×100[7]。

1.7 数据分析

数据采用DPS 7.5软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离、筛选

从35份土样中共分离筛选出121株平板菌落特征不同的拮抗菌株,其中28株有抑菌效果,经过多次纯化复筛,其中W118与W12菌株抑菌效果最好,且比较稳定,W118拮抗圈直径达到30 mm以上,W12菌株拮抗圈直径为28 mm(图1)。

图1 拮抗菌株对茄科劳尔氏菌的平板抑制效果Fig.1 Inhibition of W12 and W118 against Ralstonia solanacearum on NA medium

2.2 拮抗菌株的16S rDNA鉴定

将菌株W12和W118的16S rDNA序列与GenBank数据库中相关序列进行BLAST比对与分析,然后通过MEGA 5.1软件采用neighbour-joining绘制系统发育树(图2)。分析结果显示,拮抗菌株W12和W118的16S rDNA基因序列与跟其比对的100株芽胞杆菌属细菌的同源相似性均在99%以上。其中W12与枯草芽胞杆菌B.subtilisDSM10 (AJ276351)的同源性最高,W118与解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciensDSM7 (NC014551)的同源性最高,因此,初步鉴定菌株W12和W118均属于芽胞杆菌属。

图2 W12(a)和W118(b)与芽胞杆菌属相关菌株基于16S rDNA基因序列的进化树Fig.2 Evolutionary tree based on 16S rDNAsequences of strain W12(a), W118(b) and related strains of Bacillus sp.

2.3 拮抗菌株脂肽类抗生素合成基因的检测与分析

通过PCR扩增法从拮抗菌株W12基因组序列中成功扩增出6个脂肽类抗生素合成基因,分别为Bam、ItuD、ItuC、ItuB、ItuA和FenB,这些基因分别为抗生素bacillomycin、iturin和fengycin的基因组成片段,其中ItuC扩增条带较暗,可能与引物的保守性有关。菌株W118扩增出5个抗生素合成基因,分别是Bam、ItuD、ItuB、ItuA和FenB,对应的抗生素分别是bacillomycin、iturin和fengycin。由此可知,菌株W12和W118有合成bacillomycin、iturin和fengycin的潜力(图3)。

2.4 拮抗菌株发酵液对番茄青枯病田间防控效果

通过表2知,在田间施用拮抗菌株发酵液能有效抑制番茄青枯病的发生。W12和W118能显著降低番茄青枯病发病率,1次灌菌后的防效分别达到19.3%和34.3%,两菌混合的防效达到37.7%,灌菌3次后的防控效果最好,其中两菌混合防效为62.3%,W118的防控效果略低,为56.7%。

图3 拮抗菌株W12和W118基因组DNA中部分脂肽类抗生素合成基因的PCR扩增产物Fig.3 PCR amplification of antagonistic genes in W12 and W118

处理Treatment1次灌菌后The1stapplicationofstrains病情指数Diseaseindex防控效果/%Controleffect2次灌菌后The2ndapplicationofstrains病情指数Diseaseindex防控效果/%Controleffect3次灌菌后The3rdapplicationofstrains病情指数Diseaseindex防控效果/%ControleffectW118(7.3±1.5)a(34.3±5.1)a(8.7±0.6)bc(49.0±8.6)a(9.3±1.5)b(56.7±4.1)aW12(9.0±1.7)a(19.3±7.8)b(12.0±1.0)b(29.7±9.1)b(13.0±2.7)b(39.7±3.1)bW12+W118(7.0±1.7)a(37.7±3.8)a(7.7±2.1)c(56.0±5.6)a(8.3±3.2)b(62.3±4.8)aCK(11.3±3.2)a-(17.3±3.2)a-(21.7±5.5)a-

1) 表中数据为平均值±标准差。同列中不同小写字母表示在0.05水平差异显著。 Data in the table are mean±SD.Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 讨论

茄科劳尔氏菌寄主广泛,可以侵染200多种植物,涉及50多个科属,其中以南方地区番茄、马铃薯以及烟草等作物受害最为严重[8]。生物防治是防控青枯病最为有效的途径,目前主要是利用微生物对其进行防控。本试验从宁波本地番茄青枯病发病严重田块的健康植株根际土壤中通过平板对峙试验分离筛选到2株拮抗菌株W12和W118,对番茄青枯菌都具有高效且稳定的抑菌作用。2个拮抗菌株是从植株根际处直接筛选而获得的,对植物本身具有很强的亲和能力,在植株根部接种后更易于在根际定殖存活。

利用生物防治手段防控番茄青枯病主要是利用生防菌在其生长发育过程中产生多种类型的具有拮抗性的代谢产物,其与植物通过直接或者间接作用达到抑制甚至杀死病原微生物的效果[9]。本试验从W12和W118菌株中均能扩增得到bacillomycin、iturin和fengycin抗生素合成基因,说明其均有产生多种拮抗性代谢产物的潜力,能够有效地抑制病原菌的生长。

有效控制田间番茄青枯病的发生是生物防治的最终目的,本试验将筛选出的两株高效拮抗菌经发酵后用于田间,其中单一菌株W118和W12在3次灌菌后的防控效果分别达到56.7%和39.7%,混合菌株在3次灌菌后的防控效果达到62.3%,说明在田间施用拮抗菌对番茄青枯病有较好的防控效果。

[1] Tan Hongming, Zhou Shining, Deng Zujun, et al. Ribosomal-sequence-directed selection for endophytic streptomycete strain antagonistic toRalstoniasolanacearumto control tomato bacterial wilt [J].Biological Control, 2011, 59(2):245-254.

[2] Xue Qingyun, Chen Yu, Li Shimo, et al. Evaluation of the strains ofAcinetobacterandEnterobacteras potential biocontrol agents againstRalstoniawilt of tomato [J]. Biological Control, 2009, 48(3):252-258.

[3] Lemessa F, Zeller W.Screening rhizobacteria for biological control ofRalstoniasolanacearumin Ethiopia[J].Biological Control, 2007, 42(3):336-344.

[4] Messiha N A S, van Diepeningen A D, Farag N S, et al.Stenotrophomonasmaltophilia:a new potential biocontrol agent ofRalstoniasolanacearum, causal agent of potato brown rot [J]. European Journal of Plant Pathology, 2007, 118(3):211-225.

[5] 丁传雨, 张国漪, 沈其荣, 等. 马铃薯青枯病高效拮抗菌的筛选、鉴定及其生物效应[J]. 南京农业大学学报, 2013, 36(4): 68-76.

[6] 郑新艳, 韦巧婕, 沈标. 生物有机肥防治马铃薯青枯病的机制研究[J]. 南京农业大学学报, 2013, 36(2):70-76.

[7] 方中达.植病研究方法[M].第3版.北京:中国农业出版社,1998.

[8] Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused byPseudomonassolanacearum[J].Annual Review of Phytopathology, 1991, 29:65-87.

[9] 卢燕回, 钟启德, 韦大跃, 等.烟草青枯病生物防治研究进展[J].广东农业科学, 2007, 38(4): 418-422.

(责任编辑：杨明丽)

Screening and identifying of antagonistic bacteria againstRalstoniasolanacearumand the control effects on tomato bacterial wilt in the field

Wang Lili1, Zhou Xudong2, Li Guoan1, Yao Hongyan1, Wang Feng1

(1.NingboAcademyofAgriculturalSciences,Ningbo315040,China; 2.NingboZhifubaoBiologicalScienceandTechnologyCo.,Ltd,Ningbo315324,China)

Bacterial strains W12 and W118, isolated from the rhizosphere soil of tomato in Ningbo，could antagonize againstRalstoniasolanacearum. Based on the 16S rDNA sequence analysis, W12 and W118 were preliminarily identified asBacillusspp. The genes responsible for biosynthesis of bacillomycin, iturin and fengycin were identified in both W12 and W118 strains by PCR amplification. The field trials showed that the control effect of mixed bacterial suspension of W12 and W118 reached 62.3% after irrigations for three times, while when used alone,the control effect of strain W118 was 56.7%, which was better than that of strain W12.

tomato bacterial wilt; antagonist bacteria; antibiotic biosynthesis genes

2016-01-28

2016-03-23

宁波市科技局一般攻关项目(2014C10051)

S 144.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.033

联系方式 E-mail: wanglili531@163.com