运动对RBP4诱导的脂代谢异常鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的影响

张明军，魏丽香

(惠州学院 体育系，广东 惠州 516007)

运动对RBP4诱导的脂代谢异常鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的影响

张明军，魏丽香

(惠州学院 体育系，广东 惠州 516007)

目的：研究运动对RBP4诱导的脂代谢异常鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的影响。方法：重组人RBP4注射建立脂代谢异常鼠模型。设一次性运动组(RBP4 One-time exercise group，ROE组)、8周有氧运动组(RBP4 aerobic exercise group，RAE组)和安静对照组(RBP4 control group，RC组)。结果：ROE组血清RBP4水平与RC组相比显著降低(P<0.05)，血清TG和肝脏TG含量无显著改变(P>0.05)。RAE组血清RBP4、TG和肝脏TG含量与RC组和ROE组相比均显著降低(P<0.01)。与RC组相比，ROE组和RAE组肝脏ACC1mRNA表达均显著降低(P<0.01)。与RC组相比，ROE组ACC1蛋白表达无显著改变(P>0.05)。与RC组和ROE组相比，RAE组ACC1蛋白表达均显著降低(P<0.01)。结论：高RBP4显著增加小鼠肝脏ACC1基因和蛋白表达增加，促进肝脏脂肪合成。8周有氧运动抑制了RBP4在肝脏的脂肪合成促进作用，改善脂代谢，机制涉及降低RBP4水平、减少肝脏ACC1基因和蛋白表达以及TG的合成。

运动；视黄醇结合蛋白4；乙酰辅酶A羧化酶1；脂肪合成；脂肪代谢

脂肪因子视黄醇结合蛋白4(RBP4)能够诱导胰岛素抵抗的产生，还能够调节机体能量平衡，根据机体能量摄取和消耗变化，调节脂肪合成、分解过程，影响脂代谢平衡，是肝脏中脂肪含量的标志物之一[4]。Xia M等[5]发现：RBP4能够诱导小鼠发生脂代谢紊乱，提高血甘油三酯(TG)水平，机制涉及增加肝脏乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)基因和其他脂肪生成基因表达，促进肝脏脂肪合成和循环TG的释放。ACC是肝脏脂肪合成的主要限速酶，催化脂肪酸(Fatty acid)生成所必需的丙二酰辅酶A(malonyl CoA)的合成过程，促进脂肪酸和TG合成释放，ACC家族中ACC1调节长链脂肪酸合成的能力显著超过ACC2[6-8]。研究还发现：运动能够降低肥胖、2型糖尿病和代谢综合征鼠和患者增高的血清RBP4，改善脂代谢异常，血脂组份TG、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平均显著降低[9-11]。

鉴于RBP4能够诱导脂代谢紊乱，升高血TG等指标，机制与增加肝脏ACC1和脂肪生成基因表达、促进肝脏脂肪合成和TG释放入血有关；而运动能够降低RBP4、TG、TC和LDL-C水平，改善脂代谢异常，推测其机制可能与运动抑制RBP4诱导的肝脏ACC1高表达、脂肪合成以及TG释放过程有关。因此，为了探索运动改善RBP4诱导脂代谢紊乱的机制，本文制备RBP4诱导的脂代谢紊乱小鼠模型，给予不同运动处方干预，观察肝脏ACC1表达、TG含量变化以及血RBP4、TG水平，探讨运动改善RBP4诱导的脂代谢紊乱机制，为肥胖、2型糖尿病和代谢综合征等高RBP4血症者的脂代谢异常运动处方治疗提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 动物造模

实验鼠采用SPF级KM小鼠[SCXK(粤)2013—0020]，广州中医药大学(大学城)实验动物中心购买，均为雄性6 周龄，体重18—22 g，喂养鼠粮为标准鼠粮，自由饮水摄食。

KM小鼠随机分为脂代谢紊乱组和对照组。脂代谢紊乱组造模采用RBP4腹腔注射的方法制备脂代谢紊乱模型[6]。具体实施方案：选用重组人RBP4，配置成为80 μg/ml的注射液，分别对造模组KM小鼠进行腹腔注射，每只KM小鼠剂量为1 mL，每日注射一次，共持续注射14天。同时给予对照组KM小鼠腹腔注射1 mL生理盐水，共注射14天。第14天完成注射后检测KM小鼠空腹血TG(mmol/L)水平，采血部位为眼眶静脉丛。脂代谢紊乱造模组KM小鼠空腹血TG浓度显著高于生理盐水注射对照组(脂代谢紊乱组：1.71±0.03，对照组：1.02±0.01,P<0.01)，RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠模型制备成功。

1.2 脂代谢紊乱鼠分组及运动方案

对RBP4诱导的脂代谢紊乱模型鼠进行随机分组，设2组运动组和1组安静对照组，即一次性运动组(RBP4 One-time exercise group，ROE组)、8 周有氧运动组(RBP4 aerobic exercise group，RAE组)和安静对照组(RBP4 control group,RC组)，每组6只。RAE组运动处方参照Ploug T[10]的方案执行：首先进行适应性游泳训练，持续3日，第4日开始执行5次/周的训练方案，每次游泳训练时间为60 min，均为无负重。ROE组取材前执行一次相同时间的无负重游泳训练方案。RC组不执行任何运动训练方案。同时还设置没有进行RBP4腹腔注射的正常安静对照组(normal control group,NC组)，共6只。

1.3 指标检测

RAE组实验鼠于第8周最后一次运动后休息过夜，第二日取材。ROE组亦于第二日执行相同运动处方后，即刻取材，NC组和RC组亦同时取材。所有实验鼠取材前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛，心脏取血，取肝组织备用。

ELISA检测小鼠KM血清RBP4水平；酶法测定血TG含量。肝脏TG含量(ummol/g肝组织)检测采用自动生化分析仪，取定量肝脏组织预先进行匀浆，提取组织液中脂质，再进行离心，检测离心后上清液，得出肝脏TG含量[12]。试剂均购买自厦门慧嘉生物公司。

RT-PCR法检测ACC1mRNA表达。一步法提取总RNA，内参β-actin上游引物：5’-AGATAGACGTGCACAGGAAG-3’，下游引物：5’-GCTGGCGAACCGCCAGAGCT-3’；ACC1上游引物：5’CAGGCCGGATGCAGGAGAAG3’,下游引物：5’GAGATGTGCTGGGTCATGTGGAC3’。逆转录依试剂盒说明书进行。凝胶分析系统分析琼脂糖凝胶电泳结果，目标基因与内参基因表达的比值为ACC1mRNA相对表达量。

免疫组化法检测肝脏ACC1蛋白表达。肝组织甲醛固定24 h，石蜡切片，脱蜡、水化和抗原恢复，内源性过氧化物酶经过封闭液处理，阻断活性。依次加入一抗、二抗(均采购自厦门慧嘉生物公司)，37 ℃孵育4 h,PBS反复冲洗，DBA显色。目标蛋白的平均光密度值(OD)做半定量表达统计，图像分析系统观测单张切片上任意5个视野。

1.4 统计学处理

数据以均数±标准差表示，各组小鼠的数据之间进行单因素方差分析，LSD检验。组间数据差异具有显著统计学意义、非常显著统计学意义分别取P<0.05、P<0.01。数据录入、处理采用SPSS16.0统计软件。

2 结果

游泳运动干预第8周后，RBP4处理的各组小鼠血清RBP4、TG含量，肝脏ACC1mRNA和蛋白表达与NC组相比均显著增加，差异均具有非常显著意义(P<0.01)(表1、表2)。

2.1 一次性运动后血RBP4、血TG、肝脏ACC1表达和肝脏TG变化

与RC组相比，ROE组小鼠血RBP4和肝脏ACC1mRNA表达均显著降低，差异均具有非常显著意义(P<0.01)(表1、图1和表2)。ROE组小鼠血TG、肝脏ACC1蛋白表达、肝脏TG含量与RC组相比，差异均不具有显著性(P>0.05)(表1、图2和表2)。

图1 小鼠肝脏ACC1mRNA表达

2.2 8周有氧运动后血RBP4、血TG、肝脏ACC1表达和肝脏TG变化

与RC组、ROE组相比，RAE组小鼠血RBP4、血TG、肝脏TG含量和肝脏ACC1蛋白表达分别显著降低，差异均具有非常显著意义(P<0.01)(表1、图2和表2)。

表1 小鼠血清RBP4、TG含量变化(n=6)

注：与NC组相比，1)P<0.01；与RC组相比，2)P<0.01；与ROE组相比，3)P<0.01。下表同。

图2 实验肝脏ACC1蛋白表达，×400

表2 小鼠肝脏ACC1mRNA和蛋白表达变化(n=6)

3 讨论

3.1 RBP4与脂代谢紊乱的关系

为了便于研究运动影响RBP4诱导的脂代谢紊乱机制，必须排除其他致脂代谢紊乱的因素，建立RBP4诱导的脂代谢紊乱模型。本研究参照Xia M[5]等的方法建模，采用了高生理剂量的RBP4(80 μg/mL)处理实验鼠。前期研究报道，典型的代谢综合征的RBP4血浆浓度在20—90 μg/mL之间，2型糖尿病和肥胖者的RBP4血浆浓度在40—90 μg/mL之间[9,13,14]，因此，本研究中RBP4的浓度具备了诱导脂代谢异常的条件。研究结果显示：与未经过RBP4处理的对照组相比，实验组血TG水平显著增加(P<0.01)，诱导产生了脂代谢紊乱，建模成功，为后续运动干预研究奠定了基础。

以往的研究虽然没有揭示RBP4与脂代谢紊乱之间的因果关系，但是发现了两者间存在的显著相关性，RBP4水平和脂代谢指标升高同时存在于肥胖、2型糖尿病以及代谢综合征者和动物。Xia M[5]等则首次揭示了RBP4与脂代谢紊乱之间的因果关系，通过体外肝细胞培养和活体研究发现，高生理剂量的RBP4能够显著增加C57BL/6J小鼠肝脏脂肪合成调节基因ACC1的表达和活性，促进肝脏脂肪合成和聚集，最终导致肝脏TG含量增加，肝脏VLDL-C向血液分泌量增加，作为血脂组份的TG水平也显著升高。

3.2 运动对RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠血TG的影响

本研究中RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠血TG显著增加，经过运动干预后，各组实验鼠血TG水平均没有完全恢复到正常生理水平(P>0.05)。与未运动的脂代谢紊乱对照组相比，一次性运动干预也未对脂代谢紊乱鼠的血TG水平产生显著影响(P>0.05)。然而与未运动的脂代谢紊乱对照组相比，8周有氧运动则显著降低了血RBP4和血TG水平(P<0.01)，结果与以往的研究一致[15-19]。然而其中的机制尚不十分清楚。

以往大量的研究均报道了运动能够调整脂代谢，降低血TG，改善血脂异常。与肥胖、代谢综合征、酒精等导致脂代谢异常的传统诱因不同，RBP4是一种新近发现的导致脂代谢异常的因素。肝脏和脂肪均是RBP4主要的分泌来源，肝脏又是RBP4发挥作用的靶器官，RBP4分别通过自分泌和内分泌作用在肝脏中发挥脂肪合成的调节功能，RBP4通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1b(PGC-1b)途径激活肝脏脂肪生成路径上的关键应答基因ACC1，促进肝脏脂肪合成和VLDL-C分泌增加，血TG水平升高，导致脂代谢紊乱[19-21]。

3.3 运动对RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的影响

研究显示，运动能够降低ACC的表达，改善脂肪合成，降低血脂水平。16周转轮运动能够显著增加肥胖大鼠肝脏ACC磷酸化水平(非活性蛋白), 减少活性ACC蛋白，降低TG含量[20]。7周的跑台训练能够显著增加肥胖性胰岛素抵抗大鼠骨骼肌ACC磷酸化，抑制骨骼肌的脂肪合成[21]。而本研究中肝脏ACC1基因和蛋白的异常表达则是由RBP4诱导的，与他人研究报道中ACC表达升高的肥胖诱因不同。

本研究观察了肝脏脂肪合成的关键应答基因ACC1表达和肝脏TG情况，来进一步探究运动影响RBP4诱导的脂代谢紊乱机制。研究结果显示，与未经过RBP4处理的正常对照组相比，无论是一次性运动还是8周有氧运动干预均未能完全逆转RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠肝脏ACC1表达和脂肪合成的病理改变(表1和表2)。然而与未运动的RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠相比，运动还是表现出了一些显著的干预效果，且一次性运动和8周有氧运动呈现了不同的变化特征。

一次性运动仅仅降低RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠肝脏ACC1基因表达(P<0.01)，未能降低实际发挥脂肪合成促进作用的ACC1蛋白表达(P>0.05)，因而肝脏脂肪合成过程并未受到实质性的影响，肝脏TG含量和释放到循环中的TG量也均未发生显著变化(P>0.05)；8周有氧运动能够显著降低RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠肝脏ACC1基因和蛋白表达(P<0.01)，肝脏TG含量和释放到循环中的TG量均显著降低(P<0.01)。提示：8周有氧运动干预后，受到RBP4自分泌和内分泌联合作用的肝脏脂肪合成过程发生了改变，尤其是脂肪合成关键调节物ACC1蛋白表达的减少，是运动改善RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠肝脏脂肪合成的主要机制。综合他人有关运动对肥胖ACC表达影响的研究结果，提示长期有氧运动对于多种原因导致的高ACC1性脂肪合成和脂代谢异常均有较理想的干预效果。

4 结语

高RBP4显著增加实验鼠血TG水平，作用方式是增加肝脏ACC1基因、蛋白表达和TG的合成，循环TG释放增加。8周有氧运动能够降低RBP4诱导的脂代谢紊乱鼠血TG水平，改善脂代谢，机制是抑制了肝脏ACC1基因和蛋白表达，降低了TG的合成和含量，循环TG释放减少。

肝脏的脂肪合成过程复杂，涉及众多脂肪合成调节因子。本研究仅通过观察肝脏ACC1和TG含量来反映肝脏的脂肪合成过程，因而尚存在一定的局限性，有待在后续的研究中不断完善。

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Effects of Exercise on ACC1 Expression and Fat Synthesis of Liver in RBP4-induced Dyslipidemia Mice

ZHANG Ming-jun，WEI Li-xiang

(Department of Physical Education, Huizhou University, Huizhou 516007, China)

Objective: To study effects of exercise on ACC1 expression and fat synthesis of liver in RBP4-induced dyslipidemia Mice.Method: RBP4-induced dyslipidemia mice model established by RBP4 intraperitoneal injection. Model rats are divided in RBP4 One-time exercise group(ROE, 8-weeks RBP4 aerobic exercise group(RAE), and RBP4 control group(RC).Results: Serum RBP4 decreases more in group ROE than group RC(P<0.05).There are no significant differences in serum TG and liver TG between group ROE and group RC(P>0.05). Serum RBP4,TG,and liver TG decreases more in group RAE than group RC and group ROE respectively(P<0.01). Liver ACC1mRNA expression decreases more in group ROE and group RAE than group RC(P<0.01).There are no significant differences in ACC1 protein expression between group RC and group ROE(P>0.05).Liver ACC1 protein expression decreases more in group RAE than group RC and group ROE respectively(P<0.01).Conclusions: RBP4 increases dramatically ACC1mRNA expression in mice liver, and facilitates liver fat synthesis. 8-weeks aerobic exercise could suppress liver fat synthesis, and improve lipid metabolism. The mechanism involves in lowering RBP4, reducing liver ACC1 expression, and TG synthesis after 8-weeks aerobic exercise.

exercise; RBP4; ACC1; fat synthesis; fat metabolism

2016-10-01

福建省自然科学基金项目(2011J01151)；广东省哲学社会科学规划项目(GD15XTY10)

张明军(1968-)，男，安徽滁州人，副教授，博士，研究方向为运动生理学。

G804 < class="emphasis_bold">文献标志码：A

A

1008-3596(2017)01-0054-06