丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜的制备及表征

蒲传奋,刘 雯,姜春伟,孙聪聪,唐文婷,孙国英

(青岛农业大学，山东 青岛 266109)



丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜的制备及表征

蒲传奋,刘 雯,姜春伟,孙聪聪,唐文婷,孙国英

(青岛农业大学，山东 青岛 266109)

采用反溶剂法构建了丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子体系，并将荷载丁香酚的玉米醇溶蛋白纳米粒子制备成纳米粒子膜。以膜的厚度、透光率、机械性能、白度、水蒸气透过系数和透油系数为指标，确定最佳制备工艺条件，并对该条件下制备的产品的抗菌性质进行测定。制得的丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子粒径在255～390 nm，且具有较好分散度。最佳制膜条件为:玉米醇溶蛋白和80%乙醇固液比为1∶10(g/ml)、甘油质量分数为20%、丁香酚质量浓度为20 μg/ml。该条件下制备的产品为淡黄色，较薄，无异味，有较好的机械性能，抗菌性较好。

丁香酚;玉米醇溶蛋白;纳米粒子;膜

丁香酚(eugenol)是丁香及丁香罗勒油的主要成分，是一种油状的有香味的化合物，具有调香、麻醉、抗菌防腐、杀虫、解热、降温、抗氧化、抗衰老等作用[1]。由于丁香酚物理性质不稳定、易在使用过程中损失掉、极难溶于水等，限制了其功效的发挥。在食品加工中直接添加，丁香酚易于暴露在空气、光照、水品组分中而自身变性或与食品组分发生反应，难以保持长时间的稳定，导致其活性的降低并且有效时间的缩短[2]。活性成分通过包埋处理可减少其与外界的接触，达到增强其溶解度和稳定性，并延长有效期的目的。在诸多包埋体系中，纳米粒子是最重要的形式之一。

玉米醇溶蛋白为玉米深加工的副产物，在水或无水乙醇中不溶，因其具有良好的成膜性而在食品、医药和化工行业被用来作为成膜材料。之前关于玉米醇溶蛋白膜的研究多集中于以玉米醇溶蛋白乙醇溶液为成膜液,直接浇铸、喷雾或涂布而成[3]。玉米醇溶蛋白可通过自组装形成纳米粒子，并进一步通过其肽链的疏水键、氢键和二硫键形成纳米粒子可食膜结构[2]。我们采用反溶剂法制备丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子，并以其为原料构建可食性膜。荷载了丁香酚的纳米粒子与食品接触需要经过从纳米粒子内迁移到膜基质中，再从膜基质迁移到食品中的二次迁移。因此纳米粒子可食膜相比传统可食膜具有更高的活性成分利用效率以及更长时间的活性[2]。研究了荷载丁香酚的玉米醇溶蛋白膜的成膜条件、理化性能、机械性能、抗菌性能和微观结构，以期开发新型的多功能可食蛋白膜。

1 材料和方法

1.1 实验材料及仪器

丁香酚(分析纯)、玉米醇溶蛋白(食品级)；主要试剂：无水乙醇、甘油(分析纯)，去离子水,琼脂-MH营养肉汤培养基,金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌ATCC25922(青岛农业大学食品微生物教研室保藏)等。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司厂；752紫外可见分光光度计，上海轩丰仪器科技有限公司；红外压片机，天津市科器高新技术公司；JJ市科精密增力电动搅拌器，上海双捷实验设备有限公司；Nicolet iS5红外光谱仪，美国 Nicolet 仪器公司；螺旋测微仪(0～25 mm)，泊头市创新工量具有限公司；TA.XT plus物性测试仪，英国SMS公司；Sartorius电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；82-5恒温磁力搅拌器，北京华人创新科技有限公司；ZE-6000色度仪，上海实立有限公司；JIB-4610F扫描电子显微镜，日本电子株式会社(JEOL)。

1.2 实验设计

1.2.1 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子的制备及粒径的测定

采用反溶剂法制备玉米醇溶蛋白粒子(水为反溶剂)，将一定量的丁香酚和玉米醇溶蛋白溶于体积分数为80%的乙醇-水溶液中，建立丁香酚与玉米醇溶蛋白的不同比例实验组。将此混合液经4 000 r/min离心10 min，除去少量不溶物。

采用动态光散射测定纳米粒子在溶液状态下的平均粒径和多分散指数。取冻干样品，配制成质量浓度0.5 mg/ml的溶液待测。采用V4.20 dispersion technology 软件(DTS)分析结果。

1.2.2 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜的制备

探索最佳制膜条件。将最佳条件下制备的纳米粒子悬浮液混合一定量的甘油制成成膜液。将成膜液倒入 18 cm×21 cm的玻璃槽中形成丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜。将丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜样品于(40±1)℃、相对湿度为 (50±1)%的恒温恒湿箱中平衡24 h，用于性能检测。

1.2.2.1 不同固液比对膜性能的影响

取4个烧杯，分别按照玉米醇溶蛋白与体积分数为80%乙醇溶液1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的比例放入玉米醇溶蛋白与乙醇溶液，加入20%的甘油(以玉米醇溶蛋白计)和20 μg/ml丁香酚充分混合，将混合液加热至60℃恒温搅拌20 min，将成膜液倾倒在玻璃槽中，在40℃烘干箱中烘干成膜。揭膜后在密封箱中回软24 h，用于性能检测[3]。

1.2.2.2 不同丁香酚添加量对膜性能的影响

按照玉米醇溶蛋白与体积分数为80%乙醇溶液1∶10的比例放入玉米醇溶蛋白与乙醇溶液，加入20%的甘油(以玉米醇溶蛋白计)，分别加入0、10、20、30 μg/ml丁香酚充分混合，将成膜液倾倒在玻璃槽上，在40℃烘干箱中烘干成膜。揭膜后在密封箱中回软24 h，用于性能检测。

1.2.2.3 增塑剂甘油添加量对成膜的影响

按照玉米醇溶蛋白与体积分数为80%乙醇溶液1∶10的比例放入玉米醇溶蛋白与乙醇溶液，丁香酚添加量为30 μg/ml，分别加入质量分数0%、10%、20%、30%甘油作为增塑剂制备抗菌膜。以此研究甘油添加量对成膜的影响。

1.3 试验方法

1.3.1 纳米粒子膜厚的测定

按照国标《塑料薄膜和薄片厚度测定-机械测量法》(GB/T 6672-2001)，测定抗菌膜的厚度。用螺旋测微器测量复合膜上5个点(随机情况下)，而后取平均值，mm。

1.3.2 纳米粒子膜机械性能的测定

将膜截成长为100 mm，宽为10 mm的待测膜样品，在膜上随机选取5个点，用螺旋测微仪测量并记录下来然后取平均值，精确到小数点后三位，作为该样品的厚度值，测定前先将膜在平衡器中平衡24 h，之后用物性测试仪进行测量，系统初始夹距设为2 cm，探头的移动速度设为100 mm/min，根据电脑仪器显示读取并记录下膜断裂时的数据[5]。

拉伸强度以TS(MPa)表示，计算公式如下：

式中，P为最大负荷，N；b为试样宽度，mm；d为试样厚度，mm。

断裂伸长率以E(%)表示，计算公式如下：

式中，L0为试样原始标线间距离，mm；L为试样断裂时距离标线间距离，mm。

1.3.3 纳米粒子膜白度测量

利用色度计分析膜表面的颜色，将样品放置在标准板进行校正，对样品 (L*、a*、b*)进行测量[2]。标准板的L*、a*、b*值分别是L*=96.68，a*=0.14和b*=1.94。每个样品，取5个不同的位置进行测量后取平均值。

1.3.4 纳米粒子膜透氧性能的测定

参考《塑料薄膜和薄膜气体透过性实验方法 压差法》(GB/T 1038-2000)[11]中塑料薄膜透气性实验方法，根据“浓度增加法”测定原理测定。

1.3.5 纳米粒子膜水溶性测定

取纳米粒子膜裁剪成1 cm×1 cm大小，置于50 ml烧杯中，105℃干燥至恒重后加入20 ml蒸馏水，于25℃水浴中磁力搅拌溶解24 h后将水倒掉，剩余的膜和烧杯一同干燥至恒重后称重。

按下式计算膜的水溶性:

式中，S为水溶性系数，%；m0为初始膜和烧杯的质量，g；m为溶解24 h并平衡干燥后膜和烧杯的质量，g。

1.3.6 纳米粒子膜水蒸气透过系数测定

膜的水蒸气透过系数根据GB 1037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》[6]进行测定，以Pv表示。

1.3.7 纳米粒子膜阻油性测定

量取5 ml花生油加至试管中，以纳米粒子膜封口后，倒置于滤纸上，在干燥器中放置3 d，测定该时间内滤纸质量的变化，按下式计算透油系数：

Po=(△W×d)/S×t,

式中,Po为透油系数，g/(mm·d)；△W为滤纸质量变化；d为膜厚度，mm；S为膜面积，mm2；t为3 d[5]。

1.3.8 纳米粒子膜红外光谱(FT-IR)

对干燥的待测样品，先用KBr压片法压片制备红外光谱测试样品，然后用傅立叶红外光谱仪对样品进行红外剖析，其检测范围为4 000～500 cm-1。

1.3.9 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜的抑菌性能测定

平板抑菌圈实验：荷载丁香酚的玉米醇溶蛋白纳米粒子膜通过两种微生物检测其抗菌性：大肠杆菌和金色葡萄球菌。剪取直径为15 mm的膜样品放置在超净台内紫外照射杀菌30 min。平板中加入琼脂-MH营养肉汤培养基，涂布105～106CFU的目标微生物。将膜样品放置在培养基表面。灭菌滤纸片在37℃下培养24 h后测量抑菌圈直径[9]。

1.3.10 扫描电镜

将经过预处理的样品剪成6 mm×6 mm大小，用导电胶将样品固定在样品台上，进行喷金镀膜。喷金后在电子束下进行表面扫描。

2 结果与讨论

2.1 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子的粒径

粒径分布在100至1 000 nm之间,平均粒径为246.67 nm,多分散指数为0.223，由图1可见丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子粒径较小，且分布均匀。

图1 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子粒径图

2.2 不同玉米醇溶蛋白和乙醇固液比对膜性能的影响

不同固液比对膜性能的影响见表1。Px为透氧系数，1015cm3·cm/( cm2·s·Pa);Pv为水蒸气透过系数，g·mm/(m2·d·kPa);Po为透油系数，g/(mm·d)。

表1 不同固液比对膜性能的影响

注：L*，白色；a*，红色；b*，黄色；1∶5,1∶10,1∶15,1∶20分别表示玉米醇溶蛋白与体积分数为80%乙醇溶液的比例；同列字母不同，表示差异显著(P<0.05)。

表1表示的是不同固液比对复合膜的厚度，拉伸强度，断裂伸长率及色度的影响。由表1可知固液比为1∶10时蛋白质质量浓度较大，其分子间更易发生二硫键与疏基交换反应，而形成稳定结构。当固液比为1∶20时，蛋白质溶液质量浓度低，溶液中蛋白质分子链较分散，单位体积中巯基数目少，不利于蛋白质分子间的相互作用，导致形成的蛋白膜抗拉强度小。且可以看出随着玉米醇溶蛋白含量的减少，复合膜的厚度先增加后减少，当固液比为1∶10时，膜厚度最大。当固液比为1∶10时，膜的机械性能最佳，拉伸强度为57.11 MPa,断裂伸长率为41.19%。水蒸气透过系数和阻油系数随着固液比的减小分别呈增大和减小的趋势。膜的阻隔性质与其组织结构密切相关。蛋白质质量浓度大时，玉米醇溶蛋白的分子交联程度大，分子间隙小，有效阻止了水蒸气的透过。玉米醇溶蛋白中非极性氨基酸含量较高，当乙醇用量较大时，成膜过程中过快的溶剂蒸发速度导致蛋白质分子的疏水性基团不能完全伸展，从而减少了膜与油相的接触位点，从而导致透油系数降低。

2.3 增塑剂甘油添加量对成膜的影响

増塑剂甘油添加量对膜性能的影响见表2。

表2 増塑剂甘油添加量对膜性能的影响

注：L*，白色；a*，红色；b*，黄色。同列字母不同，表示差异显著(P<0.05)。

表2表示的是不同甘油质量分数下膜的厚度、拉伸强度、断裂伸长率及色度。随着甘油质量分数从10%增加到20%，复合膜的拉伸强度减小，断裂伸长率升高。但当甘油质量分数继续增加至25%时，复合膜的拉伸强度又增大，断裂伸长率降低。在成膜过程中甘油作为一种增塑剂，结合玉米醇溶蛋白分子上的亲水基团，使玉米醇溶蛋白分子围绕甘油成为具有均一结构的复合薄膜。随着甘油添加量的增加，玉米醇溶蛋白分子之间的结合力逐渐减弱，蛋白质分子之间的化学键和力逐渐被蛋白质分子与甘油分子间的化学键和力所代替，使得分子之间的空隙变大，造成拉伸强度降低，伸长率增加。但当甘油质量分数超过20%时，甘油由于过饱和而析出，造成了拉伸强度的增加。甘油含量增加，断裂伸长率增加，这是因为甘油作为小分子量的亲水性物质，一方面与蛋白质中的亲水基团结合，另一方面与水分子结合，起到了结合蛋白质分子和水分子的增塑作用，因此降低了复合薄膜的脆度，增加了其柔韧性。综合拉伸强度与断裂伸长率的结果，得出20%为最适添加量，这时，膜的拉伸强度为26.13 MPa,断裂伸长率为40.1%。由表2还可以看出，甘油对膜的厚度也有一定的影响。随着甘油含量的增加，膜的L*值逐渐减小，即膜的透明度逐渐减小，当甘油质量分数为20%时，透明度最小，L*为76.74。膜的透氧系数和水蒸汽透过率随甘油含量的增加而增大。这是因为甘油分子具有亲水性，同时甘油的引入也影响玉米醇溶蛋白聚合物分子链的移动性，从而增加氧和水蒸气的透过性。膜的透油系数则随甘油含量的增加而减小，是因为甘油与蛋白质及水分子之间形成氢键，增加了膜的阻油性能。膜的阻隔性质防止被包装的物品内部脂质过氧化反应的发生，减少霉变。综合上述各指标，20%甘油为最适添加量。

2.4 不同丁香酚添加量对膜性能的影响

不同丁香酚添加量对膜性能的影响见表3。

表3 不同丁香酚添加量对膜性能的影响

注：L*，白色；a*，红色；b*，黄色。同列字母不同，表示差异显著(P<0.05)。

由表3可知，丁香酚的添加量对膜厚度有一定的影响，随着丁香酚含量的增加，膜的拉伸强度及断裂伸长率都逐渐减小，尤其断裂伸长率变化较为明显，当丁香酚添加量达到30 μg/ml时，纳米粒子发生一定程度的聚集，影响了膜的均一性，因此膜的机械性能显著降低。膜的透氧系数、水蒸气透过系数和透油系数也随丁香酚添加量的增加而增加，这是因为油相的引入减少了氢键作用，从而破坏了蛋白膜的网络结构，并增加了膜结构的疏散度，因此其阻隔性质下降。

经过上述研究实验后，最终选定玉米醇溶蛋白和甘油固液比为1∶10；甘油质量分数为20%；丁香酚添加量为20 μg/ml为最佳制膜条件。并以此条件制膜对其进行性能研究。

2.5 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜水溶性(WVP)的测定

经试验测定，膜的水溶性在(27.73±1.08)%左右。蛋白膜的阻隔性能可用于控制食品与环境之间的水分、氧气、二氧化碳的交换和风味组分等的迁移,防止食品的品质劣变,延长食品的货架期。

2.6 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜红外光谱图

丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜红外光谱图见图2。

图2 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜红外光谱图 a.丁香酚添加量20 μg/ml;b.未添加

2.7 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜电镜扫描

通过扫描电镜对复合膜进行表面微观形貌观察，见图3。

图3 通过扫描电镜对复合膜进行表面微观形貌观察

由图3可见，复合膜颗粒单层均匀分散，彼此不粘连，微观组织结构较为紧密，无间隙，表明丁香酚和玉米醇溶蛋白在膜中具有良好的相容性[9]。

2.7 丁香酚/玉米醇溶蛋白纳米粒子膜抑菌性能

平板抑菌圈性能测定结果见图4。

图4 平板抑菌圈性能测定结果

由图4可见，玉米醇溶蛋白纳米粒子膜本身具有一定的抑菌能力，添加了丁香酚后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径均增大，且对大肠杆菌的抑制效果高于对金黄色葡萄球菌的抑制效果。丁香酚/玉米醇溶蛋白复合膜抑菌效果显著，可应用于食品等包装行业[10]。

3 结论

玉米醇溶蛋白纳米粒子的平均粒径为246.67 nm,具有良好的分散度。丁香酚与玉米醇溶蛋白复合膜的制备技术参数为：玉米醇溶蛋白和乙醇固液比1∶10，甘油质量分数20%，丁香酚添加量20 μg/ml。此条件下制备的产品为淡黄色，较薄，无异味，有较好的机械性能，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌性能。获得的复合膜结构均匀致密。可应用于食品活性包装。

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[2] 黎亢抗.玉米醇溶蛋白纳米粒子膜的制备及其抗菌膜材料的研究[D].广州：华南理工大学，2013.

[3] 周秋娟.木薯淀粉-壳聚糖成膜特性的研究[D].无锡：江南大学,2007.

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(责任编辑：梅 竹)

Preparation and characterization of eugenol-zein nanoparticles film

PU Chuan-fen,LIU Wen,JIANG Chun-wei,SUN Cong-cong,TANG Wen-ting,SUN Guo-ying

(Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The eugenol-zein nanoparticles films was prepared using antisolvent method.The optimum preparation conditions were determined by the thickness of the film,transmittance,mechanical properties,whiteness,water vapor permeability coefficient and permeability coefficient,and the antibacterial properties of the products prepared under the conditions were also measured.The optimum preparation conditions were as:the ratio of solid to liquid was 1∶10 (g/ml),the content of glycerol was 20% and the content of eugenol was 20 μg/ml.Under the conditions,the diameters of the particles were 255-390 nm,and the film was a little yellow color with no peculiar smell and had good mechanical and antibacterial properties.

eugenol；zein；nanoparticle;film

2016-10-06；

2016-11-17

青岛农业大学应用型人才培养特色名校建设工程2015年大学生科技创新项目；青岛农业大学应用型人才培养特色名校建设工程教学研究项目(XJG2013159)；青岛农业大学高层次人才科研基金(6631115030)；山东省高等学校科技计划项目(J16LE22)；山东省博士基金(BS2015SW019)。

蒲传奋(1980-)，男，硕士，讲师，研究方向为粮油深加工及工程化。

唐文婷(1981-)，女，博士，讲师，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.009

TS201.2+1;TS206.4

A

1003-6202(2017)01-0035-06