绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表达

阮 涛，曹一丁，刘贝贝，杨 睿，展宝睿，张士尧，马 龙，翟 蓉，杨忠华*

(1.武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉430081；2.武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212)

绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表达

阮 涛1，曹一丁1，刘贝贝1，杨 睿1，展宝睿1，张士尧1，马 龙1，翟 蓉2，杨忠华1*

(1.武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉430081；2.武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212)

以前期分离筛选得到的高产纤维素酶菌株TrichodermavirensZY-01的总RNA为模板合成cDNA，经PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因；并构建了pET-32a-cbh1表达载体，通过转化至E.coliBL21(DE3)中，获得CBH Ⅰ重组表达系统，成功表达出可溶性CBH Ⅰ蛋白。结果表明，TrichodermavirensZY-01 CBH Ⅰ碱基序列与TrichodermavirideAS 3.3711 CBHⅠ基因(GenBank：AY368686.1)序列相似度高达91.95%，氨基酸同源性高达99.22%；通过SDS-PAGE检测，表明该基因在E.coli中得到可溶性表达，分子量约为53 kDa，与基因翻译出的氨基酸序列相一致。该研究为CBH Ⅰ基因的工程化及应用提供了基础。

绿木霉；纤维素酶；外切葡聚糖酶；CBH Ⅰ基因；基因重组；原核表达

纤维素广泛存在于植物残体中，是一种重要的可再生资源，随着农业的发展，秸秆类是纤维素生物质的主要来源之一。然而在我国，大多数秸秆被直接焚烧处理，不仅浪费了大量资源，也污染了环境，若加以有效利用，不仅能有效解决资源问题，也能帮助我们解决大气污染的问题[1]。纤维素酶是用来水解纤维素的一类复合酶，主要包括外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，CBH)、内切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。然而，天然纤维素酶的酶活及产量较低等因素限制了纤维素酶的大规模工业化应用。

CBH是降解天然纤维素的主要组分，属于水解酶第七家族，是存在于真菌中的组成型纤维素酶，主要作用于结晶纤维素，能从纤维素链的非还原末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖单位，在打开纤维素天然晶体的结构中起到重要作用。因此国内外学者对CBH进行了大量的研究，大多在真核表达系统中进行表达。如张煜等[2]将TrichodermareeseiCBH Ⅱ基因转化到毕赤酵母表达系统中进行了表达；黄时海等[3]克隆了TrichodermakoningiiCBH Ⅰ基因，并在毕赤酵母中成功表达，表达产物酶活24.1 U·L-1；刘泽寰等[4]从绿木霉中克隆得到CBH Ⅱ基因，并在酿酒酵母中成功表达，培养液中表达产物的酶活可达7.7 U·mL-1；Godbole 等[5]将里氏木霉中的CBH Ⅰ基因进行了克隆，并在毕赤酵母中成功表达；丁新丽等[6]构建了能够同时表达CBH Ⅰ和EG Ⅰ基因的重组酵母工程菌。而随着基因工程技术的飞速发展，已有80多种纤维素酶的相关基因被克隆，大多数都可在E.coli中进行原核表达[7-8]。

绿木霉是高效的纤维素酶产生菌之一。作者从实验室前期筛选出的高产纤维素酶菌株TrichodermavirensZY-01中克隆出CBH Ⅰ基因，并将其转化到E.coliBL21(DE3)中进行原核表达，为构建高效纤维素酶工程菌株提供技术基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

绿木霉(Trichodermavirens)ZY-01由本实验室筛选保存，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC No：M 2012205)。克隆菌E.coliDH5α、表达宿主菌E.coliBL21(DE3)、表达载体质粒pET-32a均由本实验室保存。

RNAprep Pure Plant Kit 植物总RNA提取试剂盒、T4DNA连接酶、DNA Marker，Tiangen公司；Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆转录试剂盒，Fermentas公司；ePfu mix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒快速提取试剂盒，武汉川流生物科技有限公司；限制性内切酶XhoⅠ、SalⅠ(HF)及相关试剂，NEB公司。

LB培养基主要用于筛选、诱导过程中E.coli的培养。SOB培养基主要用于Inoue法制备E.coli超级感受态细胞。

1.2 方法

1.2.1T.virensZY-01总RNA的提取及逆转录合成cDNA

根据RNAprep Pure Plant Kit 植物总RNA提取试剂盒说明书提取T.virensZY-01的总RNA。以总RNA为模板，根据Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆转录试剂盒说明书，逆转录合成cDNA，保存于-70 ℃，用作PCR模板。

1.2.2 引物设计

根据GenBank收录的与绿木霉(T.virens) ZY-01 CBH Ⅰ同种属菌含有的CBH Ⅰ基因序列信息，以及质粒pET-32a上的多克隆酶切位点，利用Primer 5.0软件设计引物，交由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物序列分别为：

正向引物：5′-CCGCTCGAGTTACAGGCACTGAGAGTAGT-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)；

反向引物：5′-ACGCGTCGACATGTATCGGAAGTTGGCCGT-3′(下划线部分为SalⅠ 酶切位点)。

1.2.3 CBH Ⅰ 基因的扩增

以cDNA为模板，通过PCR扩增出CBH Ⅰ基因片段。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒对扩增产物分别进行回收和纯化，用1%琼脂糖凝胶电泳检测回收和纯化效果，并保存于-20 ℃用于后续操作。1.2.4 重组质粒pET-32a-cbh1的构建及测序鉴定使用质粒快速提取试剂盒提取质粒pET-32a，采用Inoue法制备E.coli超级感受态细胞。将回收纯化后的PCR产物和质粒载体pET-32a分别用XhoⅠ和SalⅠ进行双酶切后，胶回收并纯化。将CBH Ⅰ基因与载体pET-32a经T4DNA连接酶于16 ℃连接过夜后，转化至感受态细胞E.coliDH5α，利用LB/Amp100抗性平板筛选得到阳性转化子。培养并利用质粒快速提取试剂盒提取质粒。

通过对重组质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒交由北京擎科新业生物技术有限公司测序，测序使用的pET-32a通用引物序列为：正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；反向引物：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。测序结果与TrichodermavirideAS 3.3711 CBH Ⅰ基因(GenBank：AY368686.1)进行碱基序列及氨基酸序列比对，并根据软件分析得到目的基因表达出的蛋白理论大小。

1.2.5 目标蛋白在E.coliBL21(DE3)中的诱导表达及鉴定

将测序正确的重组质粒pET-32a-cbh1用热激法导入表达菌E.coliBL21(DE3)中，挑取阳性菌落至LB/Amp100液体培养基中，于37 ℃、200 r·min-1振荡培养3 h。待OD600为0.4～0.6时，降温至30 ℃，加入IPTG诱导CBH Ⅰ基因的表达。IPTG终浓度0.5 mmol·L-1，诱导时间6 h，诱导温度30 ℃。12 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀，用pH=7.4的Tris-HCl缓冲液对菌体进行重悬，反复冻融后，进行超声破胞，破胞后于4 ℃、10 000 r·min-1离心，收集上清液和沉淀，分别加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳检测。实验中设置对照组如下：

实验组：重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，加IPTG诱导。

对照组1：导入质粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG诱导。

对照组2：不含质粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG诱导。

对照组3：重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，不加IPTG诱导。

2 结果与讨论

2.1 T.virens ZY-01总RNA的提取

T.virensZY-01总RNA提取产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.RNA提取产物图1 RNA提取产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophorogram of RNA extraction

从图1可以看出，28 s亮度是18 s的两倍，表明成功提取出总RNA。

2.2 PCR扩增CBH Ⅰ基因

以T.virensZY-01的总RNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA，再以cDNA为模板克隆得到目的基因CBH Ⅰ，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对PCR产物回收纯化后，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.PCR产物图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由图2可以看出，目的条带大小约1 700 bp，与GenBank公布的CBH Ⅰ基因大小(1 746 bp)基本相符，说明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

2.3 重组质粒pET-32a-cbh1的构建

分别对PCR产物及质粒pET-32a进行XhoⅠ和SalⅠ双酶切，经连接、转化、筛选后，将阳性转化子于含Amp抗性的LB液体培养基中培养后，提取质粒，利用XhoⅠ和SalⅠ进行双酶切，酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.重组质粒双酶切产物图3 重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophorogram of recombinant plasmid products by double digestion

由图3可以看出，图中出现大小约为1 700 bp和5 900 bp的条带，与预期结果相符，表明重组质粒pET-32a-cbh1构建成功。

2.4 重组质粒pET-32a-cbh1的测序鉴定

T.virensZY-01 CBH Ⅰ与T.virideAS 3.3711 CHB Ⅰ基因的碱基序列比对结果如图4所示，氨基酸序列比对结果如图5所示。

图4 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ与T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ碱基序列比对结果Fig.4 CBH Ⅰ gene base sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

图4比对结果表明，T.virensZY-01 CBHⅠ基因与T.virideAS 3.3711 CBHⅠ基因的碱基序列的相似度高达91.95%。与T.virideAS 3.3711碱基序列相比，T.virensZY-01 CBH Ⅰ基因的序列中有4个碱基突变，分别为C突变为T、G突变为A、G突变为A、G突变为A，并且显示有两段内含子序列，可能是因为RNA模板存放时间较长，或实验前没有加入DNAase进行消化，导致模板中混入了基因组DNA。根据测序结果，分析CBH Ⅰ蛋白分子量约为53 kDa，编码513个氨基酸，与T.virideAS 3.3711编码的514个氨基酸相比，有4个编码氨基酸不同(甘氨酸突变为谷氨酸，天冬氨酸突变为天冬酰胺，脯氨酸突变为精氨酸，还有一个氨基酸缺失)，同源性高达99.22%(图5)。此结果进一步说明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

图5 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ与T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ氨基酸序列比对结果Fig.5 Amino acid sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

2.5 目标蛋白的诱导表达及分子量鉴定

分别对重组菌菌体总蛋白、破胞后的上清液及沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，结果见图6、图7。

M.protein marker 1.对照组1 2.对照组2 3.对照组3 4.实验组

图6 菌体总蛋白SDS-PAGE电泳

Fig.6 SDS-PAGE electrophorogram of total bacterial protein

从图6可以看出，全蛋白中有约为53 kDa的蛋白条带。

M.protein marker 1.对照组1沉淀 2.对照组2沉淀 3.对照组3沉淀 4.实验组沉淀 5.对照组1上清液 6.对照组2上清液 7.对照组3上清液 8.实验组上清液

图7 CBH Ⅰ蛋白的SDS-PAGE电泳

Fig.7 SDS-PAGE electrophorogram of CBH Ⅰ protein

从图7可以看出，破胞上清液及沉淀中均有53 kDa的蛋白条带，这与利用DNA测序预测的蛋白分子量相符合，说明CBH Ⅰ基因成功在E.coliBL21(DE3)中表达，一部分为可溶性蛋白，一部分可能以包涵体的形式存在。

2.6 讨论

到目前为止，人们已从近百个物种中克隆到纤维素酶基因，主要来自细菌和真菌[9]，而大多数真菌都能够合成纤维素酶，绿木霉就是木霉属中纤维素酶表达量较高的菌株之一。纤维素酶作为生物降解纤维素过程中的一个复合酶，其组分相互协作，有序作用，各组分的比例由微生物内部的调控机制进行调控[1]。因此，将产纤维素酶菌株中某种纤维素酶单一组分的基因进行克隆、表达，对研究纤维素酶降解纤维素的机制以及寻找合适纤维素酶的组合比例有重要的意义。

考虑到真核基因在原核中表达普遍存在表达量低的现象，所以本研究利用具有T7 lac强启动子的pET-32a质粒作为表达载体，克隆T.virensZY-01中的CBH Ⅰ基因，并在E.coliBL21(DE3)进行诱导表达，检测过程中发现在破胞后的上清液和沉淀中均有目标蛋白条带，可能是因为真核基因在原核中表达时一部分蛋白以包涵体的形式存在于细胞内。该蛋白的酶学性质，探究pH值、温度、金属离子种类及浓度等对酶催化效率的影响，优化蛋白表达的条件，提高蛋白表达量以及更换为真核表达系统的工作还在进一步研究之中。

3 结论

成功克隆得到了绿木霉(T.virens) ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因，其开放阅读框为1 700 bp，编码513个氨基酸，与GenBank编号为AY368686.1的T.virideAS 3.3711 CBH Ⅰ 基因进行序列比对，其碱基序列相似度为91.95%，氨基酸序列的同源性高达99.22%。同时，利用pET-32a质粒构建了重组菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，使目的基因CBH Ⅰ得以在E.coliBL21(DE3)中初步表达，对破胞前菌体总蛋白和破胞后的上清液、沉淀分别进行了SDS-PAGE电泳，结果显示，目的蛋白CBH Ⅰ是胞内蛋白，并且一部分以可溶性蛋白的方式存在于菌体内，还有一部分可能以包涵体的形式存在于细胞内，其蛋白分子量约为53 kDa。

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Cloning of CBH Ⅰ Gene fromTrichodermavirensZY-01 and Its Expression inE.coli

RUAN Tao1，CAO Yi-ding1，LIU Bei-bei1,YANG Rui1，ZHAN Bao-rui1，ZHANG Shi-yao1，MA Long1,ZHAI Rong2,YANG Zhong-hua1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081,China；2.CellegeofLifeScienceandChemistry,WuhanDonghuUniversity,Wuhan430212,China)

CBHⅠgenewasclonedbyPCRwithsyntheticcDNAusingthetotalRNAofTrichoderma virensZY-01,whichisahigh-yieldcellulasestrainandscreenedinourpreviouswork,asatemplate.TheexpressionvectorpET-32a-cbh1wasconstructedandtransformedintoE.coliBL21(DE3)toobtaintheCBHⅠrecombinantexpressionsystem.AndthesolubleCBHⅠproteinwassuccessfullyexpressed.Theresultsshowedthat,thebasesequencesimilarityofCBHⅠtoTrichoderma virideAS3.3711CBHIgene(GenBank:AY368686.1)wasashighas91.95%andtheaminoacidhomologywas99.22%.TheresultofSDS-PAGEindicatedthattheexpressedproteinwassolubleinE.coliandhadamolecularweightofabout53kDa,whichwasconsistentwiththeaminoacidsequencetranslatedfromthegene.ThisworkprovidesthebasisfortheindustrialapplicationofcellobiohydrolaseCBHⅠgene.

Trichoderma virens;cellulase;cellobiohydrolase;CBHⅠgene;generecombination;prokaryoticexpression

国家自然科学基金资助项目(21376184)，教育部回国人员科研启动基金资助项目，湖北省教育厅科研重点项目(D20121108)，生物强化技术与新进冶金工业废水创新团队项目

Q 786 Q 556.5

A

1672-5425(2017)01-0027-05

阮涛，曹一丁，刘贝贝，等.绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表达[J].化学与生物工程，2017，34(1)：27-31.