发酵鲜湿米粉的优良菌种选育及品质研究

马 霞，李路遥，何 艳，程朝辉，于海燕,*

发酵鲜湿米粉的优良菌种选育及品质研究

马 霞1，李路遥1，何 艳1，程朝辉2，于海燕1,*

（1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.上海绿晟实业有限公司，上海 202156）

从大米发酵液中分离得到一株优势菌株，命名为S2219。经形态学特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析鉴定其为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），进而比较纯菌种发酵、自然发酵及不发酵米粉的蛋白质、脂肪、淀粉含量、质构及感官品质。结果显示，纯菌种发酵米粉的蛋白质和脂肪质量分数均低于自然发酵和不发酵米粉，但其直链淀粉质量分数高于自然发酵和不发酵米粉；质构感官方面，纯菌种发酵明显改善了米粉的咀嚼性、弹性和回复性。米粉制备的最佳发酵方式是纯菌种发酵，其获得的米粉具有柔韧劲道、口感滑润的特点。

乳酸乳球菌；分离；米粉；蛋白质；脂肪；淀粉；质构

大米是人类最重要的谷类食物之一，世界人口一半以上以它为主粮[1]。中国是世界上最大的稻米生产和消费国，其中口粮消费占总消费的80%。企业在食品生产加工过程中会产生大量的碎米，这些碎米品质较好但外形较差，因此很难售出，往往都被销毁或做饲料，造成了极大的浪费。在众多大米加工食品中，米粉能够对大米进行彻底利用，提高大米的利用率和经济价值。

在中国，传统的米粉生产有发酵法与非发酵法之分。非发酵法是我国米粉早期生产的一种方法，多为家庭作坊式生产，技术落后，卫生质量差[2]。而且米粉不像小麦粉含有麦胶蛋白和麦谷蛋白，无法形成面筋，缺乏应有的黏弹性和韧性，因而非发酵法已较少使用[3]。发酵法是加工谷物类食品的传统方法，发酵谷物产品的营养价值较和消化率高、保质期较长[4-5]。闵伟红等[6]研究发现发酵后的米粉更加柔韧劲道，弹性增强。传统发酵米粉是自然发酵的过程，即将大米浸泡一定时间使其自然发酵，从而获得比非发酵法更好的口感和品质。但自然发酵受环境影响较大，容易滋生杂菌，产品易腐败变味，质量不稳定。目前国内对米粉自然发酵过程中的微生物的研究基本处于空白，对微生物特性不了解，因而难以制定工艺流程，生产过程较难控制，无法实现工业化大生产。纯菌种发酵是在自然发酵初始加入已知菌株进行发酵，它可以从根本上避免传统发酵法的微生物污染问题，解决自然发酵产品品质差、质量不稳定的问题，提高米粉的微生物安全性[7-8]。

本研究从大米自然发酵液中分离纯化得到优势菌株，并对其进行形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析。将鉴定后的菌株用于大米发酵，比较纯菌种发酵与不发酵、自然发酵在脂肪、蛋白质、淀粉含量以及质构和感官方面的差异性，以期为工业化大生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

早籼米（2014年产于上海） 上海跃进食品有限公司。

MRS培养基、平板计数琼脂、孟加拉红培养基、新型微生物微量生化鉴定管（071880、071890） 广东环凯微生物科技有限公司；纯直链淀粉、支链淀粉标准样品美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

BK1000生物显微镜 重庆光电仪器公司；GNP-9080型隔水式恒温培养箱、DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；TV-6000PC紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；ATN-300型全自动蛋白质测定仪（配有消化炉） 上海洪纪仪器设备有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；TA.XTPlus物性测定仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 自然发酵液主要微生物菌落总数的测定

参照文献[5]的方法稍作改动。乳酸菌计数采用涂布法，细菌总数、酵母菌及霉菌计数采用倾注法。

1.3.2 乳酸菌的分离纯化

参照文献[9]的方法稍作改动。将发酵液划线接种到MRS琼脂培养基，37 ℃恒温培养后镜检，挑取形态不同的单菌落转接5 次。纯化后的菌种悬浮于15%甘油中，于－60 ℃冰箱保存。

1.3.3 乳酸菌的鉴定

将革兰氏染色阳性且过氧化氢酶阴性的菌株初步确定为乳酸菌，对乳酸菌的菌株进行生理生化实验。

将分离得到的优势菌株进行16S rDNA序列分析加以鉴定。采用SK8255（细菌）基因组提取试剂盒提取优势菌株基因组DNA，以其为模板，27F和1492R分别为正向和反向引物，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物化工有限公司完成测序。得到的16S rDNA序列利用EzBioCloud数据库进行搜索比对，寻找与其同源性最高的且已知分类地位的菌种，用MEGA5.1软件对所有序列进行多序列比较排齐，以邻接（Neighbor Joining）法构建系统发育树[10]。

1.3.4 米粉的制备

乳酸菌悬液的配制：取鉴定后的乳酸菌进行活化增殖培养后，接种于MRS液体培养基，在37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，直到乳酸菌浓度达到6×108CFU/mL。

大米发酵：参照文献[11-12]并稍作调整。称取100 g大米样品置于1 000 mL烧杯中，加水400 mL，上封保鲜膜，置于37 ℃的恒温培养箱中静置，其中不发酵大米静置3 h，自然发酵大米静置48 h，两种发酵方式均不添加任何菌种；纯菌种发酵时，加入已灭菌的去离子水，大米与去离子水的比例为1∶1.2（m/V），将其混匀后加入分离得到的优势菌种乳酸乳球菌菌悬液，菌悬液的接种量为体积分数3%，上封保鲜膜，置于37 ℃的恒温培养箱中静置发酵48 h。

大米粉的制备：待其发酵好后，分别取出沥干水，所得米粒用自来水冲洗3 遍，再用蒸馏水冲洗3 遍，于磨浆机上加0.6 倍蒸馏水磨浆，所得米浆过80 目筛，一部分滤液在高速离心机上3 000 r/min离心5 min脱去多余的水分，所得粉团于－40 ℃、15 Pa条件下用真空冷冻干燥机干燥48 h，此为发酵大米粉样品。

米粉的制备：另取70 g滤液置于不锈钢饭盒（15 cm×20 cm）中摊平，汽蒸8 min后于4 ℃条件下静置2 h，复蒸8 min，后用4 ℃冷水冷却，然后切条，即为米粉样品，用于全质构分析和感官评价。

1.3.5 蛋白质含量测定

参照GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》的凯氏定氮法测定大米粉中的蛋白质含量。

1.3.6 脂肪含量测定

参照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》的索氏抽提法对大米粉中的脂肪含量进行测定。

1.3.7 淀粉含量的测定

采用双波长法测定大米粉中的直链和支链淀粉含量[13]。1.3.8 全质构分析

将复蒸冷却后的米粉切条，每一份均切成长（60±2） mm、宽（15±1） mm、厚（3.0±0.5）mm的长方形样品，用游标卡尺精确的测出每一个样品的长宽厚，并计算出面积。之后将制成的样品放在全质构分析仪上进行测定，每个样做3 组平行实验。参数设定：采用TPA模式、P/25探头、测前速率为2 mm/s、测中和测后速率为1 mm/s、触发力为5.0 g、压缩程度为75%。

1.3.9 感官评价

参照文献[14]的方法对不同发酵方式得到的米粉成品进行感官评定。评分标准见表1。

1.4 数据统计分析

采用统计软件SAS 8.2及Microsoft Excel 2010进行实验数据的统计与分析，结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 大米自然发酵液菌落计数结果大米自然发酵2 d的发酵液中主要微生物种类及计数见表2。结果表明，在自然发酵过程中，主要微生物种类为乳酸菌，酵母和霉菌相对较少。乳酸菌和细菌的菌体浓度均达到108CFU/mL，而酵母菌和霉菌的菌体浓度为105CFU/mL，说明大米发酵液中的主要微生物是乳酸菌，可以认为乳酸菌为大米发酵液中的优势菌种[15]。

表2 自然发酵液微生物计数Table2 Microbial counts of naturally fermented rice

2.2 乳酸菌的分离纯化

图1 菌株的形态学特征Fig. 1 Morphological characteristics of the isolated strain

将自然发酵2 d的发酵液于MRS琼脂培养基上进行分离纯化，经革兰氏染色观察、过氧化氢酶检验后，得到10 株乳酸菌，菌落及菌体细胞形态见图1。由图1a可知，菌株在MRS培养基上的单菌落呈中等大小、乳白色、中间凸起、边缘光滑、湿润、有光泽、不透明，采用接种环挑取单菌落发现其质地黏稠。图1b为光学显微镜下观察得到的乳酸菌形态特征，菌株呈圆球形，以单个、成对、成链状的方式排列。

2.3 生理生化特性分析

表3 菌株的生理生化实验结果Table3 Physiological and biochemical properties of the strain

对分离得到的10 株乳酸菌进行再次纯化，将纯化后的菌株通过乳酸菌生化鉴定盒进行初步鉴定，具体鉴定结果见表3。由表3可知，菌株的生理生化实验出现两种结果，有7 株乳酸菌呈现出第1种结果，有3 株乳酸菌呈现出第2种结果，通过将生化鉴定结果与常见细菌系统鉴定手册GB 4789.35—2010《食品微生物学检验 乳酸菌检验》中乳酸菌菌种主要生化反应比较，初步鉴定，第1种实验结果的菌株为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），第2种实验结果的菌株为猪肠链球菌（Streptococcus hyointestinalis），从第1种实验结果的菌株中选一株进行16S rDNA基因测序。

2.4 16S rDNA基因序列分析

图2 基于16S rDNA基因序列建立的乳球菌属系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of Lactococcus based on 16S rDNA sequences

从测序公司获得的菌株的16S rDNA基因序列大小为1 327 bp，EzBioCloud搜索后发现，该菌株基因序列与乳球菌属内种的同源性最高，与L. lactis subsp. tructae的同源性为99.97%，与乳酸乳球菌乳酸亚种（L. lactis subsp. lactis）的同源性为99.92%，与乳酸乳球菌乳脂亚种（L. lactis subsp. cremoris）和乳酸乳球菌霍氏亚种（L. lactis subsp. hordniae）的同源性均为99.85%。参照1.3.3节方法进行多序列比较，绘制出系统发育树。

由图2可知，菌株S2219同L. lactis subsp. tructae在同一个分支上，说明两者的亲缘关系最近，且两者的同源性为99.97%，同时结合2.3节生理生化结果，可以确定测试菌株为乳酸乳球菌，但是无法判定该菌株的具体亚种，若要精确确定到亚种，则还需要结合其他的鉴定手段，如特定基因（pheS、ropA、recA等）序列比对分析及其他分子生物学检测技术等。

2.5 发酵对大米粉中蛋白质、脂肪质量分数的影响

图3 不同发酵方式的大米粉中蛋白质、脂肪质量分数变化Fig. 3 Comparative protein and fat contents of rice noodles fermented with different starter cultures

由图3可知，与不发酵大米粉中的蛋白质质量分数（8.30%）相比，自然发酵和纯菌种发酵的大米粉的蛋白质质量分数均呈现明显下降，分别为5.51%和4.03%，且纯菌种发酵下降的趋势更大；而自然发酵和纯菌种发酵得到的大米粉中的脂肪质量分数分别为0.80%和0.42%，较不发酵大米粉的脂肪质量分数（1.51%）也呈明显的下降趋势。因而可知纯菌种发酵在发酵过程中对大米的蛋白质和脂肪质量分数作用明显。

发酵过程中，无论是自然发酵还是纯菌种发酵，降低的主要原因可能是在发酵过程中微生物利用蛋白质作为氮源生长繁殖，消耗掉了一部分蛋白质，同时由于米粉发酵中的微生物都具有蛋白酶活性，发酵过程中会降解蛋白质，导致蛋白质的含量减少。米粉中蛋白质的含量减少，一方面可以使淀粉得到纯化，另一方面由于蛋白质会在淀粉颗粒表面形成坚固的网状结构，限制淀粉颗粒的膨胀吸水，不利于凝胶结构的形成，因而蛋白质降解后淀粉能够更好地形成结实的凝胶结构，使米粉具有较好的特性[16]。

大米中的脂肪含量虽然较少，但大多是以直链淀粉的双螺旋结构存在，形成了复杂的化合物，限制淀粉的膨润，不利于淀粉凝胶的形成，使米粉的聚合性和咀嚼性下降，同时对其成品的口感也有一定的影响[17]。脂肪质量分数的降低可能是游离脂肪酸的流失和微生物发酵造成的，由2.1节菌落计数结果可知，发酵液中的微生物主要为乳酸菌、酵母菌和霉菌，其中乳酸菌是大米发酵液中含量最多的一种微生物，发酵开始后乳酸菌大量繁殖，产生的乳酸使发酵液pH值降低，不仅抑制了其他微生物生长，同时保证了微生物安全[18-19]，而乳酸菌和霉菌可以产生脂肪氧化酶，使脂肪降解而溶出，脂肪质量分数降低，而纯菌种发酵微生物作用效果更为显著。

2.6 发酵对大米粉中淀粉含量的影响

表4 不同发酵方式大米粉中淀粉质量分数Table4 Comparative starch contents of rice noodles fermented with different starter cultures %

由表4可知，自然发酵的直链淀粉、支链淀粉以及总淀粉质量分数与不发酵相比，无明显变化。纯菌种发酵的大米粉中直链淀粉和总淀粉质量分数有所增加，直链淀粉质量分数由不发酵大米粉的25.38%增加到31.00%，总淀粉质量分数由不发酵的62.88%增加到66.70%，说明纯菌种发酵微生物作用对于纯化淀粉、提高直链淀粉质量分数和改善米粉品质具有积极作用。

在发酵过程中，由于大米中支链淀粉的微晶结构较直链淀粉晶体的结构松弛，易被微生物利用，所以发酵液中的霉菌、细菌等会优先利用支链淀粉，对其进行轻度降解[20]，因而支链淀粉质量分数稍有降低，同时乳酸菌对脂肪和蛋白质的降解使与之结合的直链淀粉释放，使直链淀粉质量分数有所增加，本结果与闵伟红[6]的研究结果基本一致，其研究表明采用乳酸菌发酵大米后直链淀粉质量分数有所增加。

2.7 鲜湿米粉全质构分析

表5 不同发酵方式米粉的质构特性Table5 Texture properties of rice noodles fermented with different starter cultures

由表5可知，鲜湿米粉纯菌种发酵的硬度、弹性、咀嚼性、回复性都与不发酵和自然发酵存在显著性差异，明显高于不发酵和自然发酵的数值。说明纯菌种发酵微生物作用可以提高米粉的硬度和弹性，改善了米粉的咀嚼性和回复性。其原因可能是发酵产生的酸及淀粉酶使支链淀粉分子发生断链及脱支，使其平均聚合度下降，平均链长变短，消弱了其再结晶的能力，提高了米粉的弹性，使米粉更加柔韧筋道[21]。另一方面，米粉中淀粉的膨胀度和直链淀粉形成的网络结构决定着米粉的胶着性和咀嚼度[22]。脂肪与蛋白质的减少，使更多原来被结合的淀粉粒释放出来，从而使其糊化时溶胀性增加，更易于形成氢键缔合，从而加速了淀粉的水化作用，促进了淀粉的糊化，使米粉的组织结构和有序结构增强，利于保持凝胶水分，维持凝胶结构。因而获得更筋道的口感和较透明的外观[23-24]。这与直链淀粉质量分数增加相一致。由表6可知，硬度与黏性、咀嚼性以及回复性呈极显著正相关（P＜0.01），与弹性相关性不显著，也就是样品的硬度在极大程度上影响着其咀嚼性和黏性。而黏性与咀嚼性、回复性呈极显著正相关（P＜0.01），说明样品越黏，其咀嚼性和回复性越好。此外咀嚼性与回复性，也呈极显著正相关（P＜0.01）。因此，口感（包括硬度、黏性、弹性、咀嚼性）是鲜米粉品质评价中最重要的因素。

表6 TPA实验中各项质构参数之间的相关系数Table6 Correlation coefficients among TPA texture parameters

2.8 鲜湿米粉的感官评价分析

表7 鲜湿米粉的感官评分Table7 Sensory scores of fresh rice noodles fermented with different starter cultures

由表7可知，纯菌种发酵米粉的总评分高于不发酵和自然发酵米粉，但不发酵和自然发酵米粉的总评分相差不大。结合表5不同发酵方式的质构特性分析，纯菌种发酵米粉的黏性、弹性以及咀嚼性远大于不发酵和自然发酵米粉，在感官评分中呈现出了相同的结果，纯菌种发酵米粉在气味、滋味以及杂质、口感方面的得分高于另外两种发酵方式，而在色泽和组织形态方面的得分与不发酵和自然发酵米粉相差不大。

3 结 论

从大米自然发酵液中分离得到优势菌株，对其进行了形态学分析、生理生化测定和16S rDNA测序，将其鉴定为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

将得到的乳酸乳球菌应用于发酵鲜湿米粉的生产，并与不发酵、自然发酵的米粉进行比较，其结果表明纯菌种发酵米粉的蛋白质和脂肪质量分数均低于自然发酵和不发酵米粉，说明纯菌种发酵可以显著改变大米粉各成分的质量分数，对大米粉中蛋白质和脂肪质量分数的改变最为明显；总淀粉质量分数变化不大，直链淀粉质量分数略有增加；同时纯菌种发酵微生物作用提高了米粉的硬度和弹性，改善了米粉的咀嚼性和回复性。在制作米粉的过程中发现纯菌种发酵米粉更易糊化，因而对纯菌种发酵淀粉热特性有必要进一步深研究。目前国内米粉的生产多为自然发酵，在以后的发展中，纯菌种发酵法将有可能会成为一种趋势。

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Strain Screening and Quality Evaluation of Fermented Fresh Rice Noodles

MA Xia1, LI Luyao1, HE Yan1, CHENG Zhaohui2, YU Haiyan1,*
(1. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China; 2. Shanghai Lvsheng Industry Co. Ltd., Shanghai 202156, China)

A dominant bacterial strain named S2219 was isolated from naturally fermented rice. This strain was identif ed as Lactococcus lactis based on its morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences. The protein, fat and starch contents, texture properties and sensory quality attributes of unfermented fresh rice noodles, naturally fermented fresh rice noodles and fresh rice noodles fermented by the strain S2219 were measured and compared. Our results indicated that the pure culture fermented rice noodles were lower in protein and fat but higher in amylose compared with the naturally fermented and unfermented samples. Moreover, the pure culture fermented rice noodles had signif cantly improved texture properties such as chewiness, springiness and resilience as well as a smoother taste than traditional fermented rice noodles. Accordingly, pure culture fermentation was the best choice for the production of fermented rice noodles.

Lactococcus lactis; isolation; rice noodles; protein; fat; starch; texture

10.7506/spkx1002-6630-201702016

TS201.3

A

1002-6630（2017）02-0098-06

马霞, 李路遥, 何艳, 等. 发酵鲜湿米粉的优良菌种选育及品质研究[J]. 食品科学, 2017, 38(2): 98-103. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201702016. http://www.spkx.net.cn

MA Xia, LI Luyao, HE Yan, et al. Strain screening and quality evaluation of fermented fresh rice noodles[J]. Food Science, 2017, 38(2): 98-103. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702016. http://www.spkx.net.cn

2016-03-04

上海市联盟技术项目（LM201443）

马霞（1971—），女，教授，博士，研究方向为发酵功能食品。E-mail：maxia0126@126.com

*通信作者：于海燕（1979—），女，副教授，博士，研究方向为食品分析。E-mail：hyyu@sit.edu.cn