椰枣果醋的制备及抗氧化作用研究

王志煌，唐敏敏，陈卫军*，宋彦博，王富有

(1.海南大学，海口 570228；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339；3.国家重要热带作物工程技术研究中心，海口 571101)

椰枣果醋的制备及抗氧化作用研究

王志煌1，唐敏敏2,3，陈卫军1*，宋彦博1，王富有2,3

(1.海南大学，海口 570228；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南 文昌 571339；3.国家重要热带作物工程技术研究中心，海口 571101)

文章采用液体发酵法制得椰枣果醋，并探讨了在发酵过程中可溶性固形物、还原糖、酒精的变化，还测定了其对羟自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基等的清除力以及对三价铁离子的还原力。结果表明：在20 ℃下，椰枣汁发酵为椰枣酒的过程中，可溶性固形物、还原糖随着发酵时间的增加而降低，并在第12天时，还原糖降为0；酒精度则随着发酵时间的增加而增加。在本次发酵结束后，其总酚含量为1.437 mg/mL，总酸含量为8.628 g/100 g。椰枣果醋的羟自由基清除率在2%浓度时达到90%，DPPH自由基清除率在8%时达到97%，ABTS+自由基清除率在40%时达到92%。椰枣果醋拥有良好的抗氧化活性，具有开发应用价值。

椰枣果醋；液体发酵；物质变化；抗氧化

椰枣(date palm)，又名海枣、伊拉克枣、波斯枣，是椰枣树的果实，含有对人体有用的多种维生素和天然糖分，具有较高的营养价值[1]。椰枣对阿拉伯人的生活至关重要，是沙特阿拉伯等中东地区的主要粮食作物，年产量超过450万吨，在确保阿拉伯国家粮食安全和生态安全中发挥着重要作用。但是，椰枣加工产业起步晚，现有产品种类单一，且技术含量不高，严重影响了椰枣产业的可持续性发展。

果醋是利用水果及水果下脚料通过微生物发酵得到的一类新型饮品，多项研究[2]指出：因果醋发酵条件比较温和，能够有效保留果品中的营养成分和多酚类活性物质，同时，微生物在发酵过程中产生了多种活性物质，如琥珀酸等有机酸，这些物质都具有一定的抗氧化能力，这使得果醋的抗氧化潜力值得开发研究。

本研究以椰枣果实为原料，研究了果醋发酵过程中的物质变化及终产品的主要化学物质含量，并对其抗氧化活性进行研究，以期为椰枣产品的深加工提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

椰枣 阿联酋，Faud；菌种 酵母菌(安琪酵母)、醋酸菌(安琪酵母)；无水乙醇、3,5-二硝基水杨酸、ABTS、水杨酸、没食子酸、DPPH、重铬酸钾 分析纯，阿拉丁试剂；铁氰化钾、硫酸铁铵 分析纯，国药集团化学试剂股份有限公司；Folin-Ciocalteu 分析纯，广州市生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

X1R台式离心机 Themo Scientific Heraeus Multifuge；DK98-Ⅱ恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司； N25紫外可见分光光度仪 上海精科仪器有限公司；XFB-400粉碎机 吉首市中诚制药机械厂；SPX-250B-Z型培养箱 上海博讯试液有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 椰枣果醋酿造

椰枣果实→去核→加水打浆→用0.2%酶酶解→过滤→100 ℃灭菌15 min→自然冷却至室温→添加酿酒酵母(添加量为0.02%)→20 ℃发酵→还原糖完全消耗时，添加醋酸菌(添加量为0.02%)，20 ℃发酵→以酸度不再变化为发酵终点。

1.3.2 还原糖测定[3]

采用DNS法。

1.3.3 乙醇含量

采用重铬酸钾比色法[4]。

1.3.4 可溶性固形物

采用手持折光仪测定。

1.3.5 总酚测定

Folin-Ciocalteu 酚法[5]。

1.3.5.1 没食子酸标准曲线绘制

Folin-Ciocalteu 试剂：取2 mol/L Folin-Ciocalteu 试剂10 mL，加蒸馏水 90 mL，充分混匀，得0.2 mol/L的Folin-Ciocalteu试剂，共100 mL。

质量分数10%的Na2CO3溶液：精密称取10.0 g无水Na2CO3，用蒸馏水溶解后，定容至100 mL。

没食子酸标准液：称取0.0050 g，用蒸馏水溶解并定容至50 mL，得到浓度为0.10 mg/mL的标准液。

操作方法：分别精密吸取0，1，2，3，4，5 mL于10 mL比色管中，加入2.0 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，5 min后加入1 mL 1.0%的碳酸钠溶液，加水补足至10 mL，充分混匀后，室温反应1 h，在700 nm下测定吸光度,以蒸管水做空白调零。

1.3.5.2 样品测定

分别配制浓度为0.01%，0.1%，1%，10%，40%，60%，100%的样品各5 mL。取2 mL待测液于10 mL比色管中，再加入2 mL Folin-Ciocalteu 试剂，摇匀，5 min后加入1 mL 1.0%的碳酸钠溶液，加水补足至10 mL，充分混匀后，室温反应1 h，在700 nm下测定吸光度，并通过标准曲线计算其总酚含量。

1.3.6 总酸测定[6，7]

1.3.7 羟自由基清除率[8-10]

本体系利用Fenton反应产生羟基自由，即H2O2与Fe2+混合后产生·OH，当体系存在水杨酸时，能有效俘获·OH当体并生成红色产物，此物质在510 nm处有最大吸收。根据文献[8-11]，修改如下：依次向试管中加入0.5 mL FeSO4溶液(0.15 mol/L)，2 mL水杨酸钠溶液(2 mmol/L)，2.5 mL蒸馏水和1 mL不同体积分数(0，2%，4%，6%，8%，10%，20%，40%，60%，80%，100%)的椰枣醋，最后加入1 mL H2O2(6 mmol/L)启动反应，37 ℃下反应1 h，离心取上清液于510 nm处测吸光度。按下式计算清除率：

式中：E为羟自由基清除率，%；A0为空白对照液的吸光度；Ai为对照-加入样品后的吸光度；Aj为样品溶液的本底吸光度。

1.3.8 DPPH自由基清除率：

根据文献[11]和[13]，修改如下：准确移取5 mL DPPH溶液(DPPH 6.0 mol/L)，加入0.6 mL不同质量分数(0，2%，4%，6%，8%，10%，20%，40%，60%，80%，100%)的样液，混匀，黑暗中放置30 min后，离心取上清液，517 nm处测吸光度。按下式计算DPPH自由基的清除率：

式中：E为DPPH自由基清除率，%；A0为蒸馏水加DPPH溶液的吸光度；Ai为样液加DPPH溶液的吸光度；Aj为样液加乙醇溶剂的吸光度。

1.3.9 Fe3+还原力测定[14]

操作方法：在试管中分别加入0.5 mL不同浓度的样品。同时加入1.0 mL的磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.8)和2.0 mL 1%的铁氰化钾溶液。混合物于50 ℃水浴20 min后加入1.0 mL 10%的三氯乙酸，室温静置10 min。取2.5 mL反应液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的氯化铁溶液。反应10 min后测定700 nm处的吸光值，该值越高说明样品的还原性越强，以Vc为阳性对照。

1.3.10 ABTS+法测定总抗氧化能力[15-18]

将5 mL 7 mmol/L ABTS盐溶液和88 μL 140 mmol/L过硫酸钾混匀于试管中，在室温、避光的条件下静置过夜，形成ABTS+自由基储备。按1∶50的比例用超纯水稀释，使其在30 ℃，734 nm波长处的吸光度为0.74±0.02。在样品管中加入200 μL样品液和3 mL ABTS溶液，对照管用超纯水代替ABTS溶液，空白管用蒸馏水代替样品溶液。以上3组在室温、避光条件下放置1 h，于734 nm处测定其吸光值。

计算公式如下:

2 结果与讨论

2.1 酒精发酵过程中还原糖含量变化

图1 酒精发酵过程中还原糖含量变化

由图1可知，发酵过程中还原糖含量不断呈下降趋势，发酵开始时含量为135 g/L，在发酵进行12天时本次发酵还原糖消耗完毕。酿酒酵母通过糖酵解等途径的代谢作用将还原糖转化为酒精以及一些有机酸等发酵产物，还原糖含量曲线可以一定程度上反映发酵活动的活跃程度。

2.2 酒精发酵过程中乙醇含量变化

图2 酒精发酵过程中乙醇含量变化

由图2可知，酒精发酵过程中乙醇含量不断呈上升趋势，在发酵进行12天左右达到10%左右。果醋的乙醇含量在10%左右酵母菌仍然能够生长繁殖，如果发酵原料未消耗完毕，乙醇含量有可能会继续上升。

2.3 酒精发酵过程中可溶性固形物含量变化

在20 ℃下发酵的椰枣醋的可溶性固形物含量见图3。

图3 酒精发酵过程中可溶性固形物含量变化

由图3可知，可溶性固形物含量呈下降趋势，并且在发酵跟踪检测的12天中可溶性固形物从22 °Brix下降到12.1 °Brix。可溶性固形物伴随着发酵进行而消耗，但到发酵结束时仍具有较高的可溶性固形物含量。

2.4 总酚含量

椰枣醋发酵完成后总酚含量通过Folin-Ciocalteu 酚法测定为1.437 mg/mL。果醋经历二次发酵会导致多酚类物质有一定损失，但仍具有较高的多酚含量。

2.5 椰枣总酸含量

总酸经过GB/T 12456-2008酸碱滴定法测定为7.727 g/dL(换算乙酸系数0.060)，符合ZBX 66004-86《液态法食醋质量标准》(≥3.5 g/dL，以醋酸计)。与之相比，各种果醋的总酸含量沙棘果醋为12.6 g/dL，柿子醋为4.4 g/dL，苹果醋为5.58 g/dL，陈醋为9.75 g/dL。

2.6 椰枣体外抗氧化能力

2.6.1 清除羟自由基(·OH)能力

图4 椰枣醋清除羟自由基(·OH)能力

由图4可知，椰枣果醋对羟自由基具有极其优良的清除能力，在试验浓度范围内，其清除能力随浓度增加而增强。当果醋体积分数在0.8%左右时，清除率约为50%。随着浓度增大至2%时，果醋对羟自由基的清除率高达90%。 当浓度大于4%时，椰枣醋对羟自由基的清除率达到100%。与之相对应的Vc在40 μg/mL时已达到50%左右的羟自由基清除率，并在100 μg/mL时对羟自由基的清除率达到87%。因此对于羟自由基的清除能力，每1 mL果醋中约相当于含有5 mg/mL的Vc。

2.6.2 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一种很稳定的自由基，是以氮为中心，特点是可以捕获“清除”其他的自由基。如果受试物能将其清除，则意味着受试物具有降低烷自由基或过氧化自由基的能力，同时能打断脂质过氧化链反应的作用。

图5 椰枣醋清除DPPH自由基能力

由图5可知，椰枣醋在浓度为2%时对于DPPH自由基清除率约为50%，在8%时达到97%的清除率。与之相比，Vc在6 μg/mL时清除率约为50%左右，而在80 μg/mL时达到95%的清除率。因此，对于DPPH自由基清除能力，每1 mL果醋中约相当于含有1 mg/mL的Vc。

2.6.3 Fe3+还原力

当一种物质具有较强的还原能力时，相应地也具有较强的抗氧化能力。若样液在700 nm处吸光值越大，则其将Fe3+转化Fe2+的量及生成的普鲁士蓝的量越多，表明其还原能力越强，即抗氧化能力越好。

图6 椰枣醋Fe3+还原力

由图6可知，椰枣醋的还原能力相对较高。椰枣醋在20%浓度时吸光值为2.5，应是此次试验体系饱和值。Vc在100 μg/mL时吸光值为1.2。

2.6.4 ABTS+法测定总抗氧化能力

ABTS+自由基清除法被广泛用于生物样品的总抗氧化能力测定。在反应体系中，经氧化后生成相对稳定的蓝绿色的水溶性自由基。抗氧化剂与自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低表明所检测物质的总抗氧化能力越强。

图7 椰枣醋和Vc的ABTS+总抗氧化能力

由图7可知，椰枣醋的清除率在浓度为10%时达到50%左右，在浓度为40%时趋于稳定并达到92%。同比，Vc清除率在40 μg/mL左右达到56%，在80 μg/mL时达到稳定，并达到93%左右。因此，对于ABTS+自由基清除能力，每1 mL果醋中约相当于含有200 μg/mL的Vc。

3 结论

本实验制备的椰枣醋总酚含量为1.437 mg/mL，总酸含量为8.628 g/100 g。此外，在发酵过程中还原糖和可溶性固形物含量不断降低，乙醇含量不断增多。清除羟基自由基、ABTS+自由基法测定总抗氧化能力、Fe3+还原力测定以及清除DPPH自由基能力的测定结果表明：椰枣果醋原醋抗氧化活性极好，并具有良好的调配潜力，很有开发价值。

后续试验拟进行椰枣醋发酵条件优化来保护原椰枣汁中的有效成分，或通过浅度发酵果酒并制备醋酸含量相对较低的椰枣果醋来缩短发酵时间以保护杨梅汁中的酚类成分，使椰枣果醋抗氧活性进一步提高。

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Research on Preparation and Antioxidant Activities of Date Palm Fruit Vinegar

WANG Zhi-huang1,TANG Min-min2,3,CHEN Wei-jun1*,SONG Yan-bo1,WANG Fu-you2,3

(1.Hainan University, Haikou 570228, China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339,China;3.National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research, Haikou 571101, China)

Discuss the changes of soluble solids, reducing sugar and alcohol in the process of liquid fermentation of date palm fruit vinegar. The fruit vinegar is researched using four different methods: hydroxyl radical scavenging,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, ABTS+radical scavenging and reducing capacity assay. The results show that soluble solids and reducing sugar are decreased with the increase of fermentation time in the fermentation process of date palm fruit vinegar under 20 ℃.In addition, reducing sugar runs out after 12 days. However, alcohol concentration increases with time. After the fermentation, the total polyphenols content is 1.437 mg/mL; the total acid content is 8.628 g/100 g. The antioxidant capacity of date palm fruit vinegar is significant. The hydroxyl radical scavenging rate is 90% when the testing concentration is 2%.The DPPH radical scavenging rate is 97% when the testing concentration is 8%, and the ABTS+radical scavenging power is 92% when the testing concentration is 40%. Strategically, the date palm fruit vinegar has potential application value because of its favorable antioxidant power.

date palm fruit vinegar;liquid fermentation; material changes; antioxidant

2016-08-11 *通讯作者

宁夏自治区科技特派员项目

王志煌(1991-)，男，福建泉州人，硕士，研究方向：食品工程。

TS264.22

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.012

1000-9973(2017)01-0052-05