MiR-155和miR-21在乳腺癌分子亚型诊断中的价值

徐 明,谢轶群,朱佳慧,黄 斌

1.黄浦区中心医院病理科,上海 200002;2.黄浦区中心医院乳腺外科,上海 200002

2011年St.Gallen国际乳腺癌会议[1]专家组建议采取新的分类方法对乳腺癌患者进行分类治疗,用ER、PR、HER2与Ki-67这些临床病理指标来定义亚型,取代基因表达阵列标准来进行分类。共分为:腔面A(Luminal A-like)型、 腔面B(Luminal B-like)型、HER2型 和三阴性(triple-negative,TNBC)型,并推荐相应的临床实践。近年来,乳腺癌分子亚型成为研究的热点,2015年St.Gallen会议[2]专家组认为,对于HER2阴性、激素受体阳性的Luminal型如何再进行区分,存在着较大争议。认为采用多基因表达检测技术可以用来指导Luminal型乳腺癌患者是否需要行化疗,但其价格也非常昂贵,所以在大部分地区并不能实施。国内外对miRNAs的研究表明其在乳腺癌肿瘤的发生过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用,miR-21和miR-155在乳腺癌各分子亚型中表达量差异有统计学意义[3-4],鉴别诊断Luminal型乳腺癌的相关研究鲜见报道。本研究通过qRT-PCR方法检测miR-155和miR-21在浸润性乳腺癌中表达量的差异,探讨其在分子亚型中的鉴别诊断价值,特别是在鉴别诊断Luminal型乳腺癌中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集黄浦区中心医院2015年3月—2015年5月期间外科手术病理证实为浸润性乳腺癌91例。年龄33～83岁,平均(57.3±11.3) 岁。患者的肿块大小，腋窝淋巴结转移数目，组织类型，分级，免疫组化ER、PR、HER-2、Ki-67，以及荧光原位杂交检测结果等病理资料完整。非特殊型浸润性癌75例,特殊亚型(包括筛状癌、浸润性小叶癌、黏液癌、伴神经内分泌癌特征的癌、化生性癌)16例,非特殊型浸润性癌中Ⅰ级 2例,Ⅱ级31例,Ⅲ级58例。腋窝淋巴结转移阳性30例,阴性61例。所有患者均接受乳腺癌改良根治术或根治术,术前均未行放化疗和免疫治疗。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂

miRcute miRNA提取试剂盒(DP501)、TIANScript M-MLV(ER104-04)试剂盒,miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒(SYBR Green,FP401)购于天根生化科技(北京)有限公司,所用引物的合成由生工生物公司合成。21-JH:UUGACUGUUGAAUCUCAUGGC,155-JH:UUUUUGCCUCCAACUGACUCCU,21-F1:TGTCGGGTAGCTTATCAGAC,155-F1: CTGTTAATGCTAATCGTGAT,T1:TGGTGTCGTGGAGTCG,U6-F:CTCGCTTCGGCAGCACA,U6-R:AACGCTTCACGAATTTGC-GT。荧光定量仪购自于美国安捷伦公司,微量进样器购自于德国Eppendorf公司。

1.2.2 总RNA提取

从-80℃冰箱中取出保存的乳腺癌组织,碾碎后按天根miRcute miRNA提取试剂盒(DP501)进行miRNA提取。采用微量荧光分光光度计测定提取液浓度以及260/280 nm处光密度(D)值,计算RNA浓度和纯度后置于-80℃保存备用。

1.2.3 反转录

按ER104-04试剂盒针对2个miRNA位点,设计2条反转录引物:21-JH,155-JH,用天根TIANScript M-MLV(ER104-04)对提取好的miRNA进行反转录,按以下步骤进行以获得cDNA:吸取2 μL反转录特异引物,50～500 ng mRNA,2 μL (10 mmol/L total) dNTPs(中性pH值),补灭菌蒸馏水至15 μL。PCR仪70℃加热5 min后迅速在冰上冷却2 min。简短离心收集反应液后加入4 μL 5×First-Strand Buffer(含有DTT),加入1 μL(200 U)TIANScript M-MLV并轻轻用移液器混匀。42℃温浴50 min,95℃加热5 min终止反应,用RNase-Free ddH2O将反应体系稀释到50 μL,取5 μL进行后续扩增反应。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-21及miR-155的表达

靶基因扩增体系:AccuPower®Plus Dualstar qPCR Master Mix 15 μL、荧光染料1 μL、RNase-free ddH2O 5 μL、各自的上游引物2 μL、通用下游引物2 μL、cDNA链5 μL。以U6作为内参。反应条件为95℃ 10 min,(95℃ 15 s,60℃ 1 min)40个循环,25℃ 1 min,扩增时做熔解曲线。根据PCR结果统计各个标本miRNA表达Ct值和与之相对应的内参Ct值。

1.2.5 组织学类型、分级

参照2012年WHO乳腺肿瘤组织学分类标准[5],分子亚型标准参照2013 St.Gallen 会议共识[6]

1.2.6 统计学处理

采用R统计学软件进行数据分析。本研究所有两组因变量及其Box-Cox变换值均采用Shapiro-Wilk检验进行正态性分布分析,对符合正态分布的数据进一步采用Fligner-Killeen检验进行方差齐性分析。对符合正态分布及方差齐性的因变量Box-Cox变换值采用单因素方差分析,而非参数数据采用Kruskal-Wallis检验进行分析,P<0.05 为差异有统计学意义。分子亚型采用Turkey HSD检验进行进一步多重比较。

2 结果

2.1 Box-Cox变换值与临床病理指标间的关系

浸润性乳腺癌中miR-21、miR-155的表达量Box-Cox变换值与临床病理指标间的关系,见表1。miR-21、miR-155相对表达量在肿瘤直径>2 cm、组织级别Ⅲ级、淋巴结转移阳性和HER2阳性的病例均有显著上调,肿瘤在>2 cm与≤2 cm相比较(P=0.021),组织级别Ⅲ级与Ⅰ～Ⅱ级(P=0.045)相比差异有统计学意义;在淋巴结转移是否阳性、HER2有否阳性相比较差异无统计学意义。miR-155相对表达量在组织级别Ⅲ级与Ⅰ～Ⅱ级(P<0.001)相比较差异有统计学意义,在肿瘤的大小、淋巴移转移是否阳性、HER2有否阳性相比较差异无统计学意义。

表1 miR-21、miR-155在浸润性乳腺癌临床病理指标中差异性表达Tab.1 The differential expression of miR-21 and miR-155 in clinical pathological characteristics ofinvasive breast cancer (±s)

2.2 Box-Cox变换值与分子亚型间的关系

浸润性乳腺癌中miR-21、miR-155表达量Box-Cox变换值与分子亚型间的关系,见表2。miR-21、miR-155的相对表达量在TNBC型、HER2型、Luminal B-like型均比Luminal A-like型显著上调,见表2。

miR-21表达量经Box-Cox变换值在分子亚型中多重比较,HER2型与Luminal A-like型差异有统计学意义(P=0.047)。miR-155相对表达量HER2型、TNBC型和Luminal B-like型分别与Luminal A-like型差异均有统计学意义(P均<0.001),见图1、2、3。

表2 miR-21、miR-155在浸润性乳腺癌分子亚型中差异性表达Tab.2 The differential expression of miR-21 and miR-155 in molecular subtypes of invasive breast cancer (±s)

图1 miR-21、miR-155的相对表达量在分子亚型中多重比较

图2 miR-21表达量的Box-Cox变换值(相对表达量)

图3 miR-155表达量的Box-Cox变换值(相对表达量)

2.3 参照WHO乳腺肿瘤分类

非特殊型浸润性癌Ⅲ级HE染色形态，免疫组织化学染色HER2 3+形态，ER高表达和PR高表达形态,见图4。

3 讨论

microRNA是一类长约19～23 nt的单链非编码RNA,广泛存在于植物和动物中。microRNA与其靶mRNA的3′-UTR(3′非编码区)特异性结合,引起靶mRNA的翻译抑制或切割降解,调控基因的表达,在细胞的生长、分化及死亡的过程中具有重要作用。

本研究显示miR-21相对表达量在肿瘤>2 cm与≤2 cm相比较(P=0.021),组织级别Ⅲ级与Ⅰ～Ⅱ级(P=0.045)相比较差异有统计学意义,这与Lee等[7]研究观点一致。miR-155相对表达量在组织级别Ⅲ级与Ⅰ～Ⅱ级(P<0.001)相比较差异有统计学意义,与Chen等[8]研究结果一致。miR-21、miR-155相对表达量在淋巴结转移是否阳性、HER2是否阳性差异没有统计学意义,与Lee等[7]一致。早期傅少梅等[9]的研究结果表明浸润性乳腺癌病理学特征,如肿瘤大小、病理类型和分化、淋巴结情况、肿瘤分期、ER、PR及p53等,与miR-155和miR-21的表达量无明显相关性；但他们认为肿瘤组织HER2阳性患者miR-155的表达量高于HER2阴性患者的表达量。本研究也显示miR-21、miR-155相对表达量在淋巴结转移阳性和HER2阳性的病例均有上调,但差异没有统计学意义，也可能与Lee等[7]认为入组标本数量不足是一致的。

图4 WHO乳腺肿瘤分类中HE、HER2、ER、PR的表达

本研究显示miR-21、miR-155的相对表达量在TNBC型、HER2型、Luminal B-like型均比Luminal A-like型显著上调。miR-21相对表达量在HER2型与Luminal A-like型相比较差异有统计学意义(P=0.047)。Lee等[7]的研究也认为miR-21相对表达量在HER2 型显著上调的比例最高,差异有统计学意义。Liu等[10]的研究发现在TNBC型miR-155相对表达量最高,其次依次是HER2型、Luminal B-like型和Luminal A-like型,相比较而言本研究HER2型相对表达量最高,这可能与有一定数量高分化TNBC型乳腺癌入组从而影响此分子亚型的相对表达量相关。本研究发现HER2型、TNBC型和Luminal B-like型miR-155相对表达量与Luminal A-like型差异均有统计学意义(P均<0.001),并且相对表达量的差异明显,可以作为鉴别诊断Luminal A-like型与TNBC型、HER2型、Luminal B-like型参考指标。2015年St.Gallen会议共识对于TNBC型、HER2型以及HER2阳性的Luminal B-like型乳腺癌的划分标准,与相应的治疗方法基本没有争议,但在Luminal型患者中(Luminal A-like型、Luminal B-like型),对于该类亚型患者的治疗选择存在不同的意见,都希望尽量避免该亚型患者治疗过度和治疗不足。但调查显示,对该亚型患者是否进行化疗的地区差异很大。本研究发现肿瘤miR-155相对表达量在Luminal B-like型显著高于Luminal A-like型,且差异有统计学意义,认为可以通过检测miR-155相对表达量避免采用多基因表达检测技术，用来指导Luminal型乳腺癌患者是否需要行化疗,并且价格也没有多基因表达检测技术昂贵,所以在大部分地区能够实施。对指导手术后Luminal型乳腺癌患者化疗方案有一定的价值。

Nina等[11]研究发现miR-21的靶向治疗可能对BRCA2突变携带者的治疗有价值。Chang等[12]的研究发现BRCA1基因可能直接抑制miR-155表达量,miR-155 可能成为治疗BRCA1突变相关乳腺肿瘤的靶基因。 Kong等[13]的研究也发现 miR-155在肿瘤血管生成中起着重要的作用,与TNBC型的乳腺癌发生相关。 这些有关miR-21和miR-155在乳腺癌分子机制方面的研究虽然还需要更多的研究来验证,但可以为乳腺癌治疗提供新的思路。

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