基于新一代测序的SNP单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症PGD中的应用

陈林君，刁振宇，徐志鹏，周建军，颜桂军，孙海翔

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学科，南京 210008)

基于新一代测序的SNP单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症PGD中的应用

陈林君，刁振宇，徐志鹏，周建军，颜桂军，孙海翔*

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学科，南京 210008)

目的 探讨基于新一代测序(NGS)的单核苷酸多态性(SNP)单体型分析在先天性挛缩性蜘蛛样指症(CCA)种植前遗传学诊断中的有效性。 方法 对活检的滋养层细胞采用多重置换扩增(MDA)的方法扩增全基因组，应用基于NGS的SNP单体型分析和直接测序两种方法对MDA产物进行CCA的种植前遗传学诊断(PGD)。 结果 应用MDA方法对活检的4枚囊胚的滋养层细胞成功地进行了全基因组扩增；通过基于NGS的SNP单体型分析发现，其中两枚是未感染CCA的囊胚，另两枚是感染CCA的囊胚；单体型分析结果与直接测序法结果一致。取卵5个月后患者移植一枚基因型正常的冷冻囊胚，于妊娠的第38周经剖宫产成功分娩一体重为2 850 g的健康婴儿。 结论 基于NGS的SNP单体型分析是单基因病的种植前遗传学诊断的有效筛查工具。

种植前遗传学诊断； 先天性挛缩性蜘蛛样指症； 多重置换扩增； 新一代测序； 单核苷酸多态性

(JReprodMed2017，26(1)：59-63)

先天性挛缩性蜘蛛样指症(congenital contractural arachnodactyly，CCA)是一种常染色体显性遗传的结缔组织病，以皱耳、蜘蛛样指、关节挛缩(尤其是肘和膝关节)、窄体型和脊柱侧弯为特点[1-2]。CCA是由原纤维蛋白2(fibrillin 2，FBN2)基因的突变引起的，这些突变(包括无义和错义突变、插入/复制以及拼接位点突变)主要分布于FBN2基因的22至36外显子之间[3-4]，目前还没有有效的治疗方法。因此，开展种植前遗传学诊断(PGD)仍是目前最好的应对策略。通过PGD可以移植基因型完全正常的胚胎，这样可以避免产前诊断中因发现患病胎儿而终止妊娠对母体造成的身心伤害。单体型分析可以将单基因病中的致病基因所在的染色体与正常染色体区分开来[5]，也可以避免直接检测中因等位基因脱扣(allele dropout，ADO)或基因重组(recombination)而导致的误诊[6-7]，特别是对于常染色体显性遗传病的PGD具有更重要的临床意义。本文阐述了基于NGS的SNP单体型分析对CCA的种植前遗传学诊断的方法。

资料和方法

一、研究对象

患者夫妇：女方正常，男方患有CCA，夫妇育有一CCA患儿，父子均具有典型的CCA临床症状，其外周血基因组DNA(gDNA)经一代测序发现CCA的致病基因(FBN2基因)33号外显子发生一错义突变(c.4274 G>A，p.Cys1425Try)。该夫妇于2014年6月来我中心要求行PGD治疗。

二、研究方法

1.促排卵、体外受精和胚胎培养：患者采用长方案降调节，于黄体中期皮下注射促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达必佳，Ferring，德国)进行降调。当降调满足要求后，给予促性腺激素(Gn)重组人卵泡刺激素(rFSH，果纳芬，Merck Serono，瑞士)150 ～ 225 U/d，当优势卵泡直径达到18 mm时给予HCG(珠海丽珠医药)10 000 U，36 h后行阴道超声介导下取卵术。成熟卵母细胞行卵胞浆内单精子注射(ICSI)授精，ICSI后16～18 h评估受精结果，以出现两个原核(2PN)的受精卵为正常受精的胚胎，胚胎采用G1/G2(Vitrolife，瑞典)序贯培养法，在37℃、三气(6% CO2，5%O2，89%N2)培养箱中培养。

2.滋养层细胞活检、囊胚冷冻和全基因组扩增：用激光在ICSI后第3天胚胎的透明带上打一个孔径为11 μm的小孔，以便滋养层细胞能够从此孔疝出。于ICSI后第5天上午对滋养层细胞疝出的囊胚行滋养层细胞活检。用活检针吸取5～10个滋养层细胞，并用激光辅助切割；活检下来的滋养层细胞用PBS(SAGE，美国)漂洗3次并迅速转移至0.2 ml PCR管中于-80℃保存。活检后的囊胚采用Kitazato玻璃化冷冻试剂盒(Kitazato Biopharma，日本)冷冻保存于液氮中。

全基因组扩增采用多重置换扩增(MDA)方法，MDA试剂盒采用REPLI-g单细胞试剂盒(Qiagen，德国)。MDA产物纯化后可以直接PCR或-20℃保存。

3.基于NGS的SNP单体型分析：在千人基因组计划数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/) 中的FBN2基因上下游5 Mb区域筛选来自CHB(北方汉人)和CHS(南方汉人)的58个最小等位基因频率均大于0.2的SNP高频突变位点和一个致病位点(FBN2的33号外显子突变位点c.4274 G>A)。登陆网站(https：//www.ampliseq.com/)提交这些位点设计引物。随后进行DNA纯化，应用试剂盒Ion AmpliSeq(Life Technologies，美国)建库和PGM(Life Technologies，美国)测序，选择若干有效位点建立单体型。

4.直接测序法：采用PCR方法扩增FBN2基因的33号外显子。

上游引物为5’-CACCCTCAGTAGAAGTCAGAATG-3’，下游引物为5’-TACATAGTCACCTGCAAGTCAAG-3’。

PCR反应体系为50 μl∶5 μl的MDA产物(100倍稀释)或100 ng gDNA，5 μl的10×PCR buffer，1.5 μl的50 mmol/L MgCl2，1 μl的10 mmol/L dNTP mix，1 μl的10 μmol/L引物，1.5 U Taq DNA polymerase(Invitrogen，美国)。PCR反应条件：96℃预变性3 min；随后以(96℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min)×40；最后延伸5 min。PCR产物经纯化后送上海生工测序。

5.冻胚移植与随访：于取卵5个月后，患者口服戊酸雌二醇(补佳乐，Bayer，德国)6 mg/d准备内膜进行冻融胚胎移植(FET)。当内膜厚度≥8 mm时，肌肉注射黄体酮(浙江仙琚制药)60 mg/d。当黄体酮补充至第6天时进行冻融胚胎移植。

在移植后的第14天测血清β-HCG水平确定妊娠情况。移植后第42天经超声检查孕囊有胎心确定为临床妊娠。妊娠21周时进行羊水穿刺。

结 果

一、体外受精、胚胎培养

患者共获取卵17枚，其中16枚成熟卵母细胞行ICSI授精。ICSI后16～18 h观察有9枚正常的2PN受精卵。ICSI后第3天有4枚胚胎发育至8-细胞，另外5枚胚胎分别发育至10-细胞、9-细胞、7-细胞、6细胞、2-细胞。ICSI后第5天有3枚胚胎发育至囊胚(编号分别为：B4、B5、B10)，第6天有1枚胚胎发育至囊胚(编号为：B13)。对这4枚囊胚成功进行了滋养层细胞活检。

二、CCA诊断结果

采用MDA方法成功对4枚活检囊胚(B4、B5、B10、B13)的滋养层细胞进行了全基因组扩增。

在单体型分析时，我们选择58个SNP高频突变位点和一个致病位点(c.4274 G>A)对父亲、母亲和CCA患儿的外周血gDNA进行检测。选择父亲在某个SNP位点上为杂合，而母亲在该位点上为纯合或杂合，同时结合CCA患儿的SNP位点，最终选择符合要求的15个SNP位点和致病位点来构建该家系单体型(表1)。

根据家系单体型结果对4个活检囊胚的滋养层细胞的MDA产物进行分析，发现B4和B10为正常囊胚，而B5和B13为感染CCA囊胚(表1)；同时在囊胚B13中发生了来源于母源的基因重组现象(表1中B13的3号SNP位点)，但该重组并没有影响PGD结果。

直接测序法结果与单体型分析结果完全一致(图1)。

三、随访结果

在妊娠38周时剖腹产一体重为2 850 g的健康婴儿，新生儿手指外型正常，其外周血gDNA中也未见致病基因突变，而父亲和CCA患儿均表现为屈曲指(图2)。

表1 基于NGS的SNP单体型分析

SNP位点父亲母亲CCA患儿B4B5B10B133GAAAAAAGAAAGAA12CTTTTTTCTTTCTT13GCGGGCGGGCGGGC16AGAAAGAAAGAAAG20TCCTCCTTTCCTCC21CACCCACCCACCCA22TCTTTCTTTCTTTC27(致病位点)GAGGGAGGGAGGGA37CACCCACCCACCCA43TATTTATTTATTTA45TCCTCCTTTCCTCC47CGGCGGCCCGGCGG54GCCCCCCGCCCGCC56GCGGGCGGGCGGGC58TATTTATTTATTTA59TCTTTCTTTCTTTC

B4和B10为正常基因型囊胚；B5和B13为CCA囊胚图1 囊胚活检滋养层细胞的直接测序结果

箭头示父亲及患儿的屈曲指图2 家庭成员的手指外型

讨 论

CCA的发病率目前无法估计，因为它与另一种遗传疾病马凡氏综合征(Marfan syndrome，MFS)在临床表型上有部分重叠，而MFS是由原纤维蛋白1(FBN1)突变引起的[8]。因此，可以从基因水平上区分这两种遗传病。在我们的报道中，CCA是由FBN2基因的33号外显子发生一错义突变(c.4274 G>A)引起的。

PGD几乎能诊断所有已知突变的遗传病，但仍有一些因素会导致PGD误诊[9]。ADO是导致PGD误诊的因素之一，对于显性遗传病而言，ADO会导致移植含有致病基因的胚胎。一旦发生误诊将会对患者造成经济上，尤其是精神上无法挽回的伤害。在诊断单基因病时一般采用多个多态(STR或SNP)位点结合致病位点进行单体型分析来发现ADO等误诊因素并防止误诊[10-11]。在我们的研究中，我们采用单体型分析和直接测序法两种方法对CCA进行诊断，确保PGD的准确性。

单体型分析方法除了可以发现ADO外，还可以区分致病基因所在的染色体和正常染色体，单倍体胚胎和二倍体胚胎。Qubbaj等[12]报道用直接测序法和单体型分析由纯合突变引起的先天性高胰岛素症(congenital hyperinsulinism)。他们对活检的卵裂球的MDA产物行直接测序，同时选用了7个连锁的STR位点来验证直接测序的准确性。其中4个胚胎中的一个胚胎经直接测序诊断为正常的胚胎，而通过单体型分析发现该致病基因所在染色体的胚胎仅仅只有来源于父源等位基因，即该致病基因所在的染色体为单倍体或单体，这个胚胎是部分单体不能被用来移植。这就是单体型分析方法的优势所在，而直接测序法是无法做到的。此外还有一个潜在的误诊因素(基因重组)也是直接测序法无法发现的。减数分裂重组也会引发误诊[7]，由于多态位点并不是致病基因本身，两者虽然紧密连锁但仍相距一定的距离，减数分裂过程中发生的基因重组可能会将多态位点与致病基因分割开来，甚至相距1 Mb的距离都会有1%的重组发生[13]。为了防止因基因重组而引发的误诊，在单体型分析时应尽可能选择更多且离致病基因上下游较远距离的多态位点。在我们的研究中，我们没有采用STR作为多态位点来进行单体型分析，而是选择在人基因组中数量更多且分布更广的SNP位点，同时结合高通量测序(NGS)来进行单体型分析。由于SNP在不同人群中发生的频率是有变化的，我们在南方汉人和北方汉人基因组中选择致病基因FBN2上下游5 Mb范围内的58个SNP高频突变位点和致病位点(c.4274 G>A)，通过NGS获得每个SNP位点的等位基因型，最终选择了其中的15个SNP位点构建家系单体型来确定致病位点所在染色体(表1)，通过家系单体型再来分析囊胚感染CCA的情况(表1)，结果发现囊胚B4和B10是没有感染CCA的正常胚胎，而囊胚B5和B13是感染CCA的胚胎。此外，我们在囊胚B13中发现了一个来源于母源性重组现象(表1)，但这个重组并没有影响PGD的结果。单体型分析与直接测序法结果完全一致(图1)，但单体型分析可以将致病位点(c.4274 G>A)所在的染色体和正常染色体区分开来，同时也可以发现重组，保证PGD的准确性，而直接测序法没有这些优势。因此，单体型分析结合致病基因检测可以作为单基因病PGD的一种策略。

虽然PGD已经成功应用于临床，但是产前诊断发现PGD仍有误诊存在。据欧洲人类生殖与胚胎协会(ESHRE)PGD联盟报道[14]，基于PCR和FISH的PGD周期中分别有0.14%和0.06%的误诊。一般建议接受PGD治疗的患者在妊娠期间做产前诊断以确保PGD的准确性[15]。我们报道的患者于妊娠的21周行羊水穿刺，在培养的羊水细胞gDNA中没有发现CCA致病基因的突变。此外，新生儿出生后具有完全正常的手指外型，其外周血gDNA也未见CCA致病基因的突变(图2)，这些都说明CCA的PGD是完全准确的。

总之，采用基于NGS的SNP单体型分析结合致病基因检测进行CCA的PGD，可以保证基因诊断的准确性，为该技术在其他单基因病诊断中的临床应用提供了研究基础。

致谢

特别感谢北京嘉宝仁和医疗科技有限公司在单体型分析上提供的技术支持。

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[编辑：侯丽]

Application of NGS-based SNP haplotyping for preimplantation genetic diagnosis of congenital contractural arachnodactyly

CHEN Lin-jun， DIAO Zhen-yu， XU Zhi-peng， ZHOU Jian-jun， YAN Gui-jun， SUN Hai-xiang*

ReproductiveMedicineCenter，DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalCollege，Nanjing210008

Objective： To investigate the effectiveness of next generation sequencing (NGS)-based single nucleotide polymorphism (SNP) haplotyping for preimplantation genetic diagnosis (PGD) of congenital contractural arachnodactyly (CCA).Methods： Multiple displacement amplification (MDA) was performed for whole genome amplification (WGA) of biopsied trophectoderm cells. NGS-based SNP haplotyping and direct mutation detection by sequencing were used for PGD of CCA.Results： MDA was successfully performed for WGA of biopsied trophectoderm cells from four blastocysts. NGS-based SNP haplotype found that two blastocysts were unaffected by CCA， while another two blastocysts were affected by CCA. These diagnostic results were consistent with the results of direct mutation detection by sequencing. One blastocyst was transferred in the subsequent frozen embryo transfer (FET) cycle five months after oocyte retrieved. A weight of 2 850 g of healthy baby was born by cesarean section at the 38thweek of gestation.Conclusions： NGS-based SNP haplotyping is an effective screening tool for PGD of monogenic disorders.

Preimplantation genetic diagnosis； Congenital contractural arachnodactyly； Multiple displacement amplification； Next generation sequencing； Single nucleotide polymorphism

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.011

2016-06-26；

2016-07-19

陈林君，男，江苏金坛人，硕士，助理研究员，生殖医学专业.(*