UPLC-MS/MS法检测黄草乌中毒人体肝脏中的主要生物碱成分

李继印，洪仕君，黄舒柏清，刘青青，任国印，李树华

草乌为毛茛科乌头属植物，主要分为北草乌和黄草乌两种。云南乌头属(Aconitum)植物资源丰富，有66种[1-2]，主要以黄草乌或滇南草乌为基源植物[3]，多分布于滇西及滇中部；其主要成分为滇乌碱、粗茎乌头碱甲、塔拉萨敏等[4]，因产地不同、种属间生物碱的含量差别较大[5]。黄草乌块根具有舒筋活络、祛风除湿、消肿止痛的功效，民间广泛用于治疗风湿和跌打损伤等病症[6]，但黄草乌毒性较强，安全范围窄，中毒案件频繁发生。由于对黄草乌的认识不充分，法医学实践中对草乌中毒案件的鉴定主要关注乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的检测。对黄草乌中毒案(事)件中毒性成分的检测报道较少，未见测定人体生物检材中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的文献报道。因此，本研究建立的粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的UPLC-MS/MS检测方法对黄草乌中药物成分分析及法医学鉴定均具有应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏标准品(成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98.0%)；8-去乙酰基滇乌碱对照品(云南中医学院马晓霞提供，纯度为94.5%)；乙腈和甲醇(色谱纯)，甲酸和乙醚(分析纯)，pH 9.2硼酸盐缓冲溶液，娃哈哈纯净水等。

1.1.2仪器UPLC-MS/MS三重四极杆串联质谱仪(Agilent1290型液相色谱仪和AB SCIEX 4000Q TRAP串联质谱仪)，电子天平(赛多利斯BT125D)，台式高速离心机(Thermo Mx120)。

1.1.3检验材料公安机关送检的检材：疑为黄草乌中毒死者肝脏组织及现场提取的黄草乌(经云南中医学院杨耀文副教授鉴定证实为黄草乌)干燥块根5 g。

1.2方法

1.2.1色谱质谱条件UPLC条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相为乙腈-0.1%甲酸(含5 mmoL乙酸铵)水溶液，梯度洗脱(0～0.5 min，乙腈体积分数为5%；0.5～5.0 min，乙腈体积分数5%→95%；5.0～5.5 min，乙腈体积分数为95%；5.5～5.6 min，乙腈体积分数95%→5%；5.6～7.5 min，乙腈体积分数5%)；流速0.5 mL·min-1，柱温35 ℃，进样体积5 μL。Mass条件：电喷雾离子源，正离子模式，三重四极杆检测器，MRM检测模式；粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的监测离子对及锥孔电压、碰撞电压等参数见表1。

表1 待测物的监测离子对和电压参数 V

1.2.2标准贮备液的配制分别精密称取10.0 mg粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏标准品于10 mL容量瓶内，用甲醇溶解定容至刻度线，振摇均匀后分别得到1.0 mg·mL-1粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的标准贮备液，置4 ℃冰箱保存。

1.2.3样品处理黄草乌的处理：称取送检黄草乌干燥块根2 g，粉碎后用甲醇浸泡5 d，得到20 mL浸泡液。取适量黄草乌浸泡液，经甲醇稀释1 000倍后，离心(10 000 r·min-1)3 min，上清液经有机滤膜(13 mm×0.22 μm)过滤后得到黄草乌样品。肝组织的处理：准确称取1 g肝组织，匀浆后，用硼酸盐缓冲液(pH为9.2)浸泡60 min，离心(15 000 r·min-1)3 min，上清液经乙醚萃取后氮气吹干，甲醇定容至1 mL，经有机滤膜(13 mm×0.22 μm)过滤，得到送检肝组织样品。

2 结果

2.1方法适用性验证在1.2.1分析条件下，分别对空白人体肝组织对照样品、粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的混合标准溶液及送检肝组织样品和黄草乌样品进行检测；各以目标物对照品的两对离子对和保留时间对送检肝组织样品和黄草乌样品中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏进行定性分析。结果显示：空白对照无干扰，方法专属性好(见图1)。

图1 样品中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的MRM图

2.2线性范围和检出限取空白人体肝组织，按“1.2.3”方法处理后，用粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的混标溶液配制质量浓度分别为1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列基质加标溶液，并配制质量

浓度分别为1、5、10、20、50、100 ng·mL-1的系列混标溶液，按“1.2.1”分析条件测定，以定量离子对的积分峰面积(A)对质量浓度(C，ng·mL-1)进行线性回归(表2)。取线性最低点溶液逐级稀释后测定，检出限以信噪比(S/N)﹥3作为评价标准，定量限以信噪比﹥10为评价标准，粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的线性方程(线性范围1～100 ng·mL-1)及检出限见表2。

2.3精密度、回收率及稳定性配制低、中、高3个浓度的空白人体肝脏添加样品(n=6)，按“1.2.3”方法处理样品，在“1.2.1”节条件下测定，记录粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的定量离子对的峰面积As，计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度；取空白肝脏组织，按“1.2.3”方法处理样品后，配制成低、中、高3个浓度的基质加标溶液(n=6)，在“1.2.1”条件下测定，记录峰面积为Am；另取上述3个浓度的混标溶液直接进样，记录峰面积为Astd。以As/Am计算提取回收率，Am/Astd计算基质效应，结果见表3。配制低、中、高3个浓度的肝脏质控样品(n=6)，在室温放置24 h及3次冻融循环后，按“1.2.3”方法处理样品，在“1.2.1”条件下测定，计算精密度，考察其短期稳定性和冻融稳定性。结果表明，粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的RSD%均低于5.0%，说明样品在上述条件下稳定。

表2 粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的线性方程及检出限(n=6)

表3 待测物的精密度、基质效应和提取回收率

2.4样品测定将“1.2.3”处理得到的送检肝组织样品和黄草乌样品，在“1.2.1”条件下测定，送检肝组织样品中定性检出粗茎乌头碱甲和滇乌碱，未检出塔拉萨敏和8-去乙酰基滇乌碱；其中粗茎乌头碱甲的含量为54.25 ng·g-1，滇乌碱的含量为125.0 ng·g-1。送检黄草乌块根中定性检出粗茎乌头碱甲、滇乌碱、塔拉萨敏和8-去乙酰基滇乌碱，其中粗茎乌头碱甲的含量为0.16 mg·g-1，滇乌碱的含量为0.43 mg·g-1，塔拉萨敏的含量为0.52 mg·g-1。

3 讨论

目前，用HPLC[8]或LC/MS[9-10]法测定草乌中的乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的报道较多，对黄草乌及黄草乌中毒案件生物检材中的主要毒性成分的检测报道鲜见，赫伟等[11]采用HPLC法测定长喙乌头中的滇乌碱、草乌甲素和黑乌弱碱；张盼盼等[12]用LC-MS/MS法检测了尿液中滇乌碱、乌头碱、次乌头碱和新乌头碱成分；刘伟等[13]用LC-MS/MS法检测了血液中的草乌甲素、乌头碱、次乌头碱和新乌头碱；李继印等[5]用UPLC-MS/MS法检测了云南5种不同产地的黄草乌中滇乌碱、粗茎乌头碱甲和塔拉萨敏的含量；未见检测黄草乌中毒人体生物检材中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的报道。本文建立的UPLC-MS/MS检测人体肝脏中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的方法，经验证同样适用于8-去乙酰基滇乌碱、乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的检测。本研究也对死者肝脏组织和对照检材黄草乌块根进行了乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的检测，均未检出这3种生物碱成分，进一步验证了本案涉及的草乌块根为黄草乌。此外，从案件涉及的黄草乌块根中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的含量可以看出：3种成分相比，塔拉萨敏的含量最高，而中毒尸体肝脏组织中却未检出塔拉萨敏成分，原因可能是塔拉萨敏化学性质不如滇乌碱和粗茎乌头碱甲稳定，或者塔拉萨敏在体内代谢较快。因此，涉及黄草乌中毒案件的检验鉴定应优先考虑滇乌碱和粗茎乌头碱甲的检验。

本文建立的方法适用于各类检材中粗茎乌头碱甲、滇乌碱和塔拉萨敏的分析检测，本研究为黄草乌中毒案件的法医学鉴定提供更多的检测目标物，为案(事)件的死亡原因分析及定性判定提供更多的依据。

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