一株鬼针草内生真菌发酵粗提液的杀线虫活性研究

沈清清，胡展育，刘 芳

（1.文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099；2. 文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

植物寄生线虫是目前世界上分布最广、对农作物危害最重的害虫，也是全世界植保界最关心、最不易解决的难题[1]。目前国际上线虫的防治方法主要有物理防治法、化学药剂防治法和农业防治法。但是这些方法都存在着成本大、技术手段要求高等问题，特别是化学方法会造成很大的次生灾害，对其它生物的生长危害特别大。因此从安全生产和绿色环保的角度出发，生物防治法成为了实现现代农业可持续发展的主要方法，其中寻找产毒真菌，从产毒真菌中分离具有杀线虫效应的活性物质是一种具有很大发展潜力的防治手段。Stirling G等[2]2004年报道从番茄根部分离获得一株尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），该菌株能有效抑制南方根结线虫对番茄的侵染，其抑制率达55%；Vu T等[3]2006年报道从香蕉上分离获得一株镰刀菌，该菌株能有效抑制香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）对香蕉的侵染，其抑制率高达85%；郝菲菲等[4]2015年报道从金线莲中分离获得的21株菌的杀松材线虫活性均大于50%，其中一株阿姆斯特丹散囊菌 （Eurotiumam stelodami） 和一株竹生炭角菌 （Xylariabambusicola）的杀松材线虫活性高达100%。鬼针草（Bidens pilosa）是一种入侵物种，由于瘦果冠毛芒状具倒刺，可附着于人畜和货物，目前广泛分布于我国各地且危害严重[5]，开发及利用其优势是双赢的治理手段。最近几年科学家们从鬼针草的水提液及其包含的各化学成分方面进行了大量的研究，但很少从其内生真菌方面进行研究。

本研究从鬼针草植株中分离到一株内生真菌，以全齿复活线虫为靶标，对该内生真菌的杀线作用进行测定，以期为进一步开发和利用鬼针草内生真菌为生防菌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种分离材料来源

鬼针草健康植株采自文山市区内。

1.1.2 供试线虫

全齿复活线虫（Panagrellus redivivus）由云南大学微生物资源开发和利用重点实验室提供。

1.1.3 培养基的制备

采集鬼针草健康植株，清洗晒干后称取茎叶300 g，剪碎后放入锅中，加入1500 mL自来水熬煮30 min，后用纱布过滤熬煮好的汁液得到鬼针草滤液，称取22.5 g蔗糖和琼脂27 g，加入鬼针草滤液中，加热直至琼脂完全熔化，后定容至1500 mL，再次过滤，分装，121℃高压蒸汽灭菌。

1.1.4 供试线虫的培养和制备

称取5～8 g无糖燕麦片于250 mL锥形瓶中，用10～20 mL蒸馏水浸泡6～7 min，塞好棉塞后用报纸封口，121℃下灭菌30 min，无菌操作法把全齿复活线虫接入燕麦片培养基。封口后置于培养箱中培养5～10 d左右。观察到有线虫在锥形瓶壁上爬时，取出放置于冰箱中，调节温度为4℃保存，备用。无菌操作条件下用贝曼氏漏斗法对线虫进行分离。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离

采集新鲜的鬼针草植株，洗净，切成0.5 cm左右的小块，用75%酒精处理1 min，然后用蒸馏水冲洗3次，2%的次氯酸钠处理2 min，蒸馏水冲洗3次，将处理好的植株块在无菌操作条件下接种到培养基上，密封，放入恒温箱中进行培养，恒温箱28℃培养7 d后，观察分析培养基上所生长的菌种，根据其菌落形态，颜色，质地等情况初步判断菌种差异，用PDA培养基对不同类型的真菌进行纯化后保存备用。

1.2.2 鬼针草内生真菌发酵粗提液的制备

纯化后的菌种严格按照无菌操作接种在PDA液体培养基中，27℃、转速200 rpm条件下置恒温振荡箱中培养4～5 d。

1.2.3 鬼针草真菌发酵粗提液对线虫的抗性试验

真菌发酵液离心后稀释，设6个浓度梯度（稀释1、2、3、5、7、9倍）和对照，各三个重复，无菌操作条件下将各浓度稀释液装入培养皿中，对照组为无菌水。把清洗好的线虫按每皿300条的方案加入对应培养皿中。以上工作完成后分别在0.5、4、12、24、48 h这5个时间点进行观察并进行数据统计。每个培养基观察10个视野，把每个视野的死亡虫数、以及10个视野死亡总虫数进行统计。

判别线虫死亡标准为针触法，即线虫被发酵液处理后，针触线虫的活动状态，当线虫呈僵直不动时为死虫，线虫呈弯曲运动状态为活虫。有时线虫和供试发酵液接触后会呈假死状态，其处理方法是将假死线虫挑出置于培养皿中，加入少许2% NaCI浸泡5 min，僵直线虫又呈运动状态，若5 min内无反应即可确定为个体死亡[6]。对杀线虫活性强弱进行分级：“－”表示校正死亡率≤10%，无杀线虫活性；“＋”表示校正死亡率为10%～30%，杀线虫活性弱；“＋＋”表示校正死亡率为30%～50%，杀线虫活性中等；“＋＋＋”表示校正死亡率为50%～80%，杀线虫活性较强；“＋＋＋＋”表示校正死亡率＞80%，杀线虫活性强[7]。

线虫死亡率:（死亡线虫数/供试线虫数）×100%。

校正死亡率:［（处理组线虫死亡率－对照组线虫死亡率）/（1－对照组线虫死亡率）］× 100%。

2 实验数据处理

采用SPSS 19.0软件和Microsoft Excel 2007对结果进行统计分析，以P＜0.05为显著差异。

3 结果与分析

3.1 内生真菌的分离

经过分离和筛选，获得并纯化出一株供试菌株，编号为GF1。

3.2 菌株GF1发酵粗提液抗线虫活性

表1为菌株GF1不同浓度的发酵粗提液对全齿复活线虫的毒杀活性统计表，由表可知GF1菌株发酵粗提液各稀释浓度作用0.5 h时对线虫的毒杀活性未显现，校正死亡率均小于5%，毒杀活性均为“－”；而发酵液原液在作用12、24、48 h时校正死亡率均高于90%，毒杀活性均为“++++”；稀释9倍的发酵液在作用0.5、4、12 h时校正死亡率均低于5%，毒杀活性均为“－”，作用24 h后才表现出杀线虫活性。由此可得菌株GF1发酵粗提液对线虫的毒杀活性随着浓度的升高而增强，而随着作用时间的延长其毒杀活性也随之提升。

表1 GF1菌株发酵粗提液抗线虫活性

表2是GF1发酵粗提液时间与组别（浓度梯度）两因素效应表， 由表分析得知时间与组别（浓度梯度）两组因素中，因为时间类型的平方和（73183.819）大于浓度的（44549.333），所以时间是主效应。另外，从表中还可看出以时间为底F=83.39，P值等于0.000小于0.01所以在各时间段之间存在显著差异。

表2 菌株GF1发酵粗提液时间与组别（浓度梯度）两因素效应

图1是菌株GF1发酵粗提液不同浓度在不同时间段的杀线作用统计图。表中数据显示，不同稀释浓度的发酵粗提液杀线作用效果存在明显差异，且随着浓度的增高杀线作用不断增强，其中原液的效果非常显著，作用线虫仅12 h就能达到94%的致死率，为该菌作为生防制剂的开发提供了极为有利的数据支撑。稀释2和3倍的浓度仅经过12 h的作用对线虫就能达到半致死效应，而3～7倍的稀释浓度经过24 h的作用对线虫也能达到半致死效应，稀释9倍时仍具有毒杀线虫的效果，作用48 h后能达到半致死效应。

以上结果表明该粗提液的作用效果非常明显。测定作用12 h时发酵粗提液与全齿复活线虫死亡关系得到回归方程：y= 97.312x+ 7.6452，R2=0.8639。由此得出该发酵粗提液作用12 h时对全齿复活线虫的半致死浓度LC50=0.435。

图 1 菌株GF1发酵粗提液不同浓度在不同时间对线虫的作用

4 结论与讨论

本试验从鬼针草植株中筛选到一株内生真菌即GF1菌株，其发酵粗提液对全齿复活线虫的毒杀活性效果显著，原液作用线虫仅12 h就能达到94%的致死率，活性随着浓度的升高而增强，随着作用时间的延长毒杀活性也随之提升，表明该菌作为生防菌株具有较高的开发价值，其研究数据为后续杀线活性物质的分离奠定了基础。

植物体内存在着大量的内生真菌，其存在的主要意义就是产生次生代谢产物以抵抗病虫害对植物的侵染[8]，目前各国都在争相研发和利用“环境和谐-相容农药”[9]，以实现国家的可持续发展，因此开发植物内生真菌为生防菌种具有巨大价值和意义。菊科植物对环境适应能力强，其中具有杀线虫活性的种类很多[9]，鬼针草属菊科植物，张天柱等[10]2010年对鬼针草杀线活性进行了测定，研究表明作用48 h后鬼针草提取物毒杀线虫的校正死亡率达62.04%，其毒杀效果显著，而本研究中从鬼针草分离获得的GF1菌株同样具有较强的杀线活性。内生真菌与植物长期协同进化过程中，可产生与其相同或相似的具有杀线活性次生代谢产物[1]，本文研究结果启示我们可将菊科植物作为重要的材料资源，以获得更多具有毒杀线虫活性的内生真菌。

[1] 李婷，黄文坤，彭德良，等. 3株生防真菌发酵液对大豆孢囊线虫的防治效果[J]. 华中农业大学学报， 2017（1）： 42-46.

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[3] Vu T, Hauschild R, Sikora R A. Fusarium oxysporum endophytes induced systemic resistance against Radopholus similis on banana[J]. Nematology，2006（6）： 847-852.

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