玫烟色棒束孢对烟粉虱致病的时间-剂量-死亡率模型分析

田 晶，田浩楷，刁红亮，付淑慧，郝 赤，马瑞燕*

（1.吕梁学院生命科学系，山西离石033000；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

玫烟色棒束孢对烟粉虱致病的时间-剂量-死亡率模型分析

田 晶1，2，田浩楷2，刁红亮2，付淑慧2，郝 赤2，马瑞燕2*

（1.吕梁学院生命科学系，山西离石033000；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

为了寻找烟粉虱生物防治的新途径，用浸叶法测定了生防菌玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱各虫态的致病力。结果表明，接种该菌株孢子悬浮液后烟粉虱各虫态均可被感染而发病死亡。在供试浓度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0×105cfu/m L）处理下，烟粉虱各虫态的累计校正死亡率均随着孢子悬浮液浓度的增加和时间的延长而升高。2龄若虫的累计校正死亡率最高，在浓度为1.0×107cfu/m L的孢子悬浮液处理7 d后达到83.05%。运用时间-剂量-死亡率模型对生物测定数据进行拟合，并估计了该菌株对烟粉虱的致死剂量与致死时间。随着接种天数的增加，烟粉虱各虫态的致死中浓度（LD50）和死亡率为90%所对应的浓度（LD90）降低，生防菌的剂量效应逐渐增强，2龄若虫在接种后7 d的LD50对数剂量估计值为4.37。生防菌的致死时间与剂量呈负相关，在1.0×105～1.0×107cfu/m L内随生防菌浓度的增加2龄若虫的致死中时（LT50）由5.66 d降到4.47 d。玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱2龄若虫有较高的致病效果，是烟粉虱生物防治的潜力菌株。

玫烟色棒束孢；烟粉虱；致病力；时间-剂量-死亡率模型；生物防治

烟粉虱（Bem isia tabaci）是一种重要的世界性害虫［1］，属于对农业危害较大的100种入侵害虫之一［2-3］。施用化学药剂是防治烟粉虱的主要方法之一，但大量化学农药的施用使烟粉虱对许多杀虫剂产生了抗药性，且抗性不断增强［4-5］。烟粉虱仅以刺吸式口器吸取作物汁液进行危害，细菌、病毒等需要通过消化道才能进入体内的生物杀虫剂无法对烟粉虱发挥作用，而虫生真菌可直接穿透寄主的表皮进入体内起作用［6］，是防治烟粉虱这类刺吸式口器害虫比较理想的生物制剂。

玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一种重要的昆虫病原真菌，分布广泛［7-9］。在比利时等国家已被开发成微生物杀虫剂，用来防治烟粉虱［10］。山西农业大学生物安全与生物防治研究室在田间分离到1株玫烟色棒束孢，该菌株对人畜安全［11］，且对烟粉虱的致病力较强［12-14］。本研究采用时间-剂量-死亡率（TDM）模型对玫烟色棒束孢侵染烟粉虱的致病力进行分析，该模型将时间和剂量效应统一于一个模型内，可考察时间与剂量效应的互作，能够体现出毒力测定数据的直观性和客观性，以便进一步探索和研究该菌株对烟粉虱的毒力作用，从而为其今后在农业生产中应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

玫烟色棒束孢IF-1106菌株，分离自山西省太谷县温室大棚中，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.7514。

将供试菌株接种到PDA培养基平板上，放入25℃霉菌培养箱中培养。待菌丝长满培养皿后，加入20 m L含0.1%吐温-80的无菌水，用接种针轻刮真菌的菌丝和孢子从而收集玫烟色棒束孢的分生孢子。将菌液倒入烧杯中，用磁力搅拌器将分生孢子打散（约30 min），用4层无菌纱布过滤到小烧杯中即得到孢子悬浮液，弃去培养基残物和杂质。再用血球计数板计数，计算母液的孢子浓度。计数后先将孢子悬浮液稀释到1.0×107cfu/m L，再分别稀释为5.0×106、1.0 ×106、5.0×105、1.0×105cfu/mL。

1.2 供试昆虫

烟粉虱来源于山西省太谷县温室大棚中，经鉴定生物型为B型。根据烟粉虱在黄瓜上的发育历期［15］，在其产卵后选取均匀一致的各虫态备用。

1.3 玫烟色棒束孢对烟粉虱的致病力测定

对若虫的致病力测定［16-18］：采用浸叶法，将带有烟粉虱1、2、3龄若虫的黄瓜叶片分别浸入不同浓度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0×105cfu/ m L）的玫烟色棒束孢孢子悬浮液中，处理20 s后取出，放在干净的滤纸上将多余的水分吸干。每处理1片叶，每叶30头虫，重复6次，以含0.1%吐温-80的无菌水处理为对照。试验叶片的叶柄需包被浸有营养液的棉花团，以保证叶片至少能保持7 d的活性。将试验叶片放入直径9 cm的培养皿中，用保鲜膜封口并扎孔以透气，然后放入温度（25.0±0.5）℃、光照14 h/d的光照培养箱中，调节光照培养箱的相对湿度在80%左右。每天镜检一次，记录死亡虫数，连续观察7 d。若虫上密布菌丝，或颜色从透明变成不透明的白或淡黄色，可认为死亡。

对成虫的致病力测定［16，18］：在培养皿中加入不同浓度（1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105、1.0× 105cfu/m L）的玫烟色棒束孢孢子悬浮液，将黄瓜顶部真叶浸入悬浮液中，将发育期一致的烟粉虱成虫在-4℃的冰箱中冷冻15 s后，轻轻拍入皿内，每皿接入成虫10头（不分雌雄），然后将培养皿置于人工气候箱中，条件设定为（25.0±0.5）℃、相对湿度80%、14 h光/10 h暗。每个处理3皿，每皿10头，共30头成虫，重复6次，以含0.1%吐温-80的无菌水处理为对照。由于相对湿度较大，对照的死虫数也较多，因此，需要将处理和对照中每天死亡的成虫移除，并保湿培养，只有成虫上有菌丝长出，才能确定是由致病菌侵染致死，连续观察7 d。

根据每天观察到的平均活虫数与死虫数计算各处理的死亡率，并以Abbott公式计算校正死亡率［19］：校正死亡率=［（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）］×100%。

1.4 模型模拟分析

对生物测定数据采用时间-剂量-死亡率模型模拟方法进行分析［20］，该模型表述如下：

式（1）中，β表示剂量效应的斜率，τj是到时间tj的时间效应参数，Pij是剂量di在第j个时间单位内产生的累计死亡概率。

由于累计死亡概率在时间上是连续的，若直接拟合则不符合模型模拟变量的独立性假设，因此考虑剂量di使试虫在时间区间［tj-1，tj］内可能遭受的死亡率即条件死亡概率，其可表示为：

式（2）中，β的含义与式（1）中相同，γj为描述时间区间［tj-1，tj］内时间效应的待估参数，与τj在时间的含义上有所区别。式（2）可进行模型拟合，获得参数

所有模拟及运算过程均采用DPS数据处理系统软件完成，模拟中各浓度下的死亡数据以对照中的自然死亡数进行校正。

2 结果与分析

2.1 不同浓度玫烟色棒束孢IF-1106菌株处理后烟粉虱逐日死亡情况

由图1可知，随孢子悬浮液接种浓度的增加，烟粉虱若虫和成虫的死亡率也增加（成虫是从接种后第4天开始死亡，故记录了第4～10天的数据）。在孢子浓度为1.0×107cfu/m L时，1、2、3龄若虫处理7 d后的累计校正死亡率分别为78.38%、83.05%、45. 72%，成虫处理10 d后的累计校正死亡率为54.98%。可见，烟粉虱2龄若虫对玫烟色棒束孢感病死亡率最高。死亡的若虫和成虫表现典型的虫生真菌致死症状，虫体保湿培养后体表都有菌丝长出。

2.2 玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱各虫态致病的TDM模型模拟

将图1中的数据导入TDM模型进行模拟分析，数据显示（表1），1、2、3龄若虫及成虫剂量效应的斜率β分别为0.331 8、0.336 6、0.405 6、0.400 1，说明3龄若虫对孢子悬浮液浓度的增加最为敏感，之后依次为成虫、2龄若虫、1龄若虫。累积时间效应参数τj随时间推移而增大，但在试验接近尾声时变化幅度减小，说明烟粉虱累计死亡率除受剂量因素影响外还受到作用时间的影响，随接种天数的增加烟粉虱死亡率的增速逐渐上升后趋于稳定。条件死亡率模型中各处理剂量与时间效应参数的t测验值均达到显著或极显著水平，即标准误差相对于参数估计值极小，说明供试菌株的剂量效应与时间效应显著。其中，时间效应参数可估计烟粉虱各虫态的死亡高峰，其在1龄和3龄幼虫接种后第6天（γ6）、2龄若虫接种后第5天（γ5）、成虫接种后第7天（γ7）达到最大，与试验观察到的死亡高峰期相吻合。

所建条件死亡率模型的Hosmer-Lemeshow拟合度测试结果见表2。已知d f=8时，由于1、2、3龄若虫及成虫的χ2分别为1.332 9、2.677 0、3.172 7和2.609 8，均小于，各模型均通过拟合异质性检验，表明所建模型均不存在异质性，即它们能够无偏描述不同浓度处理下玫烟色棒束孢与烟粉虱不同虫态间的互作关系。

2.3 玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱各虫态致死的剂量效应

根据TMD模型估计玫烟色棒束孢IF-1106菌株接种烟粉虱各虫态的剂量效应值，有效致死剂量是一个时间相关函数，由模型参数τ和β确定。从剂量效应值的变化来看（图2），随着接种天数的增加，各虫态的致死中浓度（LD50）和死亡率为90%所对应的浓度（LD90）降低，菌株的剂量效应逐渐增强。玫烟色棒束孢对烟粉虱各虫态的剂量效应整体呈现为在接种后的前5 d变化明显，反映出这期间死亡率变化较大，此后变化减小并趋于稳定。从LD50和LD90的变化范围来看，2龄若虫随时间的推移下降范围最大，成虫最小。各龄若虫接种后7 d和成虫接种后10 d的LD50对数剂量估计值分别为4.73、4.37、7.43、6.83，LD90对数剂量估计值分别为8.34、7.94、10.39、9.83。由于3龄若虫实际累计最高死亡率未达到50%，因此模型估计的LD50偏大，并且试验中各虫态的实际累计死亡率均未达到90%，模型估计的LD90也会偏大。该结果表明，达到同一致死水平的时间越长，所需孢子悬浮液的浓度越低。

2.4 玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱各虫态致死的时间效应

由DPS数据处理软件处理相关数据获得玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱的致死中时（LT50）。3龄若虫因为最高浓度下的累计校正死亡率未超过50%，因此无法计算出LT50值，而成虫只有在高浓度（1.0×107cfu/m L）下才得到LT50为7.63 d。因1、2龄若虫的累计校正死亡率较高，在各浓度下均计算得到LT50，在孢子悬浮液浓度为1.0× 105～1.0×107cfu/mL时，致死时间与浓度呈负相关趋势，从低到高不同浓度下1龄若虫的LT50依次为5.93、5.54、5.19、4.78、4.57 d，2龄若虫的LT50依次为5.66、5.09、4.91、4.59、4.47 d。由此可见，2龄若虫致死所需的时间最短。

3 结论与讨论

玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱不同虫态的致病力测定结果表明，供试昆虫的不同虫态均出现被感染而死亡的现象，其中2龄若虫的累计校正死亡率最高，3龄若虫的累计校正死亡率最低，在高浓度孢子悬浮液（1.0×107cfu/m L）接种7 d后死亡率分别为83.05%、45.72%。从剂量效应角度来看，3龄若虫的β估计值最大，为0.405 6，其后依次为成虫（0.400 1）、2龄若虫（0.336 6），可见3龄若虫对菌株的浓度变化最为敏感。从时间效应角度来看，烟粉虱各虫态接种病原真菌后的死亡高峰期大体一致，即主要集中在接种后的第5天和第6天，2龄若虫致死所需时间最短。将剂量效应和时间效应综合考虑，初步得出玫烟色棒束孢IF-1106菌株可作为生物防治烟粉虱的优良菌株，在2龄若虫期喷施具有最佳的防治效果。

本试验结果表明，玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱2龄若虫的致病力最高，但是从条件死亡率模型的分析结果可得出，其对孢子悬浮液浓度变化的敏感程度小于3龄若虫及成虫。该结果反映了2龄若虫在所设定的不同菌株剂量范围内，其死亡率相对于其他虫态处于较高的数值且稳定增长，进而表明适当浓度的玫烟色棒束孢IF-1106菌株即可造成烟粉虱2龄若虫大量死亡。有研究表明，虫生真菌主要从体壁侵入，低龄幼虫的体壁较薄，真菌孢子容易穿透侵染，但玫烟色棒束孢对1龄若虫的致病力稍微低于2龄若虫。可能是由于1龄若虫较2龄若虫的表面积小，致使真菌侵染机会减小；而高龄幼虫和成虫体壁蜡质层增厚，防卫机制发育健全而增强了抗病性，使真菌孢子难以穿透侵染［23-24］。

TDM模型将时间和剂量效应统一到一个模型中，通过模型拟合计算出有效致死剂量与致死时间，比概率值分析更精确地反映真实情况，避免概率值分析中时间效应与剂量效应相互脱节的问题。2种效应的交互作用体现在：接种不同浓度玫烟色棒束孢孢子悬浮液后，随着时间的推移，达到一定死亡水平所需的孢子悬浮液浓度会逐渐降低；同样，随着剂量的增加，达到有效致死水平的时间会逐渐缩短。因此，LD50随时间的下降趋势和LT50随剂量的下降趋势可以更加可靠地评价该菌株的应用潜力。

本研究发现，在烟粉虱2龄若虫期喷施玫烟色棒束孢孢子悬浮液具有较好的防治效果，且2龄若虫对菌株孢子悬浮液浓度的增加不太敏感。实际生产应用时，在能够达到理想的杀虫效果下，可以适当降低该菌株生物制剂的浓度及用量，这样可以提高药剂的利用率，减少成本。根据本研究建立的致死浓度与致死时间互为函数的关系，田间用药的浓度应当根据害虫发生情况和防治目标的实际需要合理制定，若不过分追求快速击倒，稍放宽对时间的要求，则菌株制剂的用量可在常规水平基础上大幅减少。

［1］ 何玉仙，杨秀娟，翁启勇.农田烟粉虱寄主植物调查初报［J］.华东昆虫学报，2003，12（2）：16-20.

［2］ White J.Silverleaf whitefly extends range［J］.California Agriculture，1998，52（2）：6-7.

［3］ 吴秋芳，花蕾.烟粉虱研究进展［J］.河南农业科学，2006（6）：19-24.

［4］ 邓业成，徐汉虹，雷玲.烟粉虱的化学防治及抗药性［J］.农药，2004，43（1）：10-15.

［5］ 刘爱芝，李素娟，武予清，等.烟粉虱无公害治理有效药剂的研究［J］.河南农业科学，2002（11）：21-22.

［6］ 王刚，董建臻，曹伟平，等.球孢白僵菌胞外蛋白酶及几丁质酶的研究进展［J］.中国农学通报，2009，25（13）：175-178.

［7］ Zimmermann G.The entomopathogenic fungi Isaria farinosa（formerly Paecilomyces farinosus）and the Isaria fumosorosea species complex（formerly Paecilomyces fumosoroseus）：Biology，ecology and use in biological control［J］.Biocontrol Science and Technology，2008，18（9）：865-901.

［8］ Mascarin G M，Kobori N N，Quintela E D，et al.The virulence of entomopathogenic fungiagainst Bemisia tabaci biotype B（Hem iptera：Aleyrodidae）and their conidial production using solid substrate fermentation［J］.Biological Control，2013，66（3）：209-218.

［9］ 念晓歌，吕利华，何余容，等.13种常用农药和玫烟色棒束孢SCAU-IFCF01的相容性研究［J］.中国生物防治学报，2014，30（2）：210-215.

［10］ 王宏民，张奂，郝赤，等.玫烟色拟青霉对小菜蛾幼虫的侵染过程及接菌方法对其致病力的影响［J］.中国生态农业学报，2009，17（4）：704-708.

［11］ 田晶，梁丽，郝赤，等.玫烟色棒束孢急性毒性及致敏实验观察［J］.山西农业大学学报（自然科学版），2013，33（2）：144-146.

［12］ Tian J，Diao H，Liang L，et al.Pathogenicity of Isaria fumosorosea to Bem isia tabaci，with some observations on the fungal infection process and host immune response［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2015，130（9）：147-153.

［13］ 田晶，李雅，刁红亮，等.环境因子对玫烟色棒束孢IF-1106菌株孢子萌发的影响［J］.天津农业科学，2016，22（4）：8-12.

［14］ 田晶，刁红亮，马瑞燕.玫烟色棒束孢侵染对烟粉虱成虫体内不同酶活的影响［J］.山西农业科学，2016，44（7）：1007-1010.

［15］ 邱宝利，任顺祥，林莉，等.不同寄主植物对烟粉虱发育和繁殖的影响［J］.生态学报，2003，23（6）：1206-1211.

［16］ 田晶，梁丽，李新凤，等.玫烟色棒束孢IF-1106菌株对烟粉虱的致病力［J］.山西农业科学，2013，41（7）：728-731.

［17］ 陈宇平，张红艳，张龙.蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）Bj085-1菌株对烟粉虱的毒力测定［J］.中国植保导刊，2010，30（11）：5-9.

［18］ 文吉辉，侯茂林，卢伟，等.印楝素不同处理方法对烟粉虱的室内毒力测定［J］.中国农业科学，2008，41（4）：1242-1247.

［19］ 张松影，林华峰，李茂业，等.几种虫生真菌菌株的培养性状及其对褐飞虱的毒力［J］.应用昆虫学报，2011，48（5）：1407-1411.

［20］ 冯明光.时间-剂量-死亡率模型取代机率分析技术［J］.昆虫知识，1998，35（4）：233-237.

［21］ 林华峰，张松影，李茂业，等.黄绿绿僵菌M f82悬乳剂对褐飞虱作用的时间-剂量-死亡率模型分析［J］.菌物学报，2013，32（2）：239-247.

［22］ 唐洁，唐启义，孙传恒，等.杀菌剂生物测定动态评价时间-剂量-抑菌率模型［J］.植物保护，2006，32（1）：34-37.

［23］ 吕利华，何余容，武亚敬，等.玫烟色拟青霉对小菜蛾致病力的时间-剂量-死亡率模型模拟［J］.昆虫学报，2007，50（6）：567-573.

［24］ 邱君志，黄志鹏，潘洁茹，等.昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究［J］.菌物学报，2004，23（1）：115-121.

Time-dose-mortality Model of Isaria fumosorosea against Bemisia tabaci（Homoptera：Aleyrodidae）

TIAN Jing1，2，TIAN Haokai2，DIAO Hongliang2，FU Shuhui2，HAO Chi2，MA Ruiyan2*
（1.Department of Life Science，Lüliang University，Lishi033000，China；2.College of Agriculture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

In order to effectively control Bemisia tabaci，the virulence of Isaria fumosorosea IF-1106 isolate against different instars of B.tabaci was evaluated by immersing leaves.Results showed that all states of B.tabaci could die after infection of I.fumosorosea.Under the treatment of I.fumosorosea conidial suspension with the concentration of 1.0×107，5.0×106，1.0×106，5.0×105，1.0×105cfu/m L，the accumulative ad justed mortality of B.tabaci increased with rise of concentration of the conidia and elongation of action time.The accumulative adjusted mortality of 2ndinstar larvaewas the highest among all instars，which reached 83.05%after 7 days of treatment by 1.0×107cfu/m L.A time-dose-mortality model conforming to Hosmer-Lemeshow goodness-of-fit testwas established to estimate the lethal dose and lethal time of Isaria fumosorosea IF-1106 against B.tabaci.With the extension of time，the dose effect increased，LD50and LD90decreased.The estimated LD50logarithm of 2ndinstar larvae on the 7th day after treatment was 4.37.The time effect was negatively correlated to the dose，and the LT50values of 2ndinstar larvaedecreased from 5.66 d to 4.47 d with the increase of the concentration in the range of 1.0×105—1.0×107cfu/m L.I.fumosorosea IF-1106 has high pathogenicity to the 2ndinstar larvae，and is promising in the biological control of B.tabaci.

Isaria fumosorosea；Bemisia tabaci；pathogenicity；time-dose-mortalitymodel；biological control

S476.12

A

1004-3268（2017）01-0070-06

2016-06-14

吕梁学院校内基金项目（ZRXN201409）；山西省煤基重点科技攻关项目（FT201402）；北京农学院农业部都市农业（北方）重点实验室开放课题（KFK-2015001）

田 晶（1987-），女，山西浮山人，讲师，博士，主要从事昆虫病理与生物防治研究。E-mail：15835898286@126.com

*通讯作者：马瑞燕（1968-），女，山西太谷人，教授，主要从事生物防治研究。E-mail：maruiyan2004@163.com