雉鸡多杀性巴氏杆菌的分离及其药敏试验

许英民

（黑龙江省铁力市172信箱，黑龙江 铁力 152500）

雉鸡多杀性巴氏杆菌的分离及其药敏试验

许英民

（黑龙江省铁力市172信箱，黑龙江 铁力 152500）

对黑龙江省铁力市某珍禽养殖场发生疑似禽巴氏杆菌病对发病雉鸡进行了细菌分离，通过染色、镜检与生化特性等试验鉴定为多杀性巴氏杆菌。经菌株的药敏试验以及致病性试验，结果表明对头孢噻呋、氟苯尼考、新生霉素、复方新诺明、三甲氧苄胺嘧啶为敏感药，对氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、链霉素不敏感。

雉鸡；多杀巴氏杆菌；鉴定；药敏试验

巴氏杆菌病又称禽霍乱、禽出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌引起的一种侵害家禽和野禽的接触性传染病，可引起禽类的急性死亡。临床症状表现为急性、亚急性或慢性败血症，发病率和死亡率都很高，是对养禽业危害非常严重的传染病之一。从2012～2015年禽巴氏杆菌病例发生的比较多，而且出现了新的流行特点，如发病的家禽品种从蛋鸡、肉鸡、鸭、鹅到肉鸽、灰雁、鹌鹑、鹧鸪、鸵鸟及雉鸡等特禽；发病禽的日龄趋于小龄化，药物控制难度大，经济损失也有所增加。

2016年3月下旬，黑龙江省铁力市某林业局一林业经营所某珍禽养殖场，饲养雉鸡740只，已开始产蛋，最近几天发现有的山鸡开始发病，表现为食欲废绝，精神萎靡，排出黄绿色粪便，开始零星死亡，而后死亡率迅速增加，每天死亡雉鸡5～8只不等，同时产蛋量有所下降。对病死雉鸡进行剖检，主要病变为心包积液，心脏有出血点；肝脏表面布满密布的坏死点；脾脏萎缩；十二指肠出现严重；血液凝固不全。根据临床症状和病理变化，初步怀疑是巴氏杆菌病。对该病例进行细菌分离，通过染色、镜检、细菌形态、培养与生化特性等试验鉴定为多杀性巴氏杆菌。

1 材料

1.1 病料来源 病料来源于黑龙江省铁力市某林业局下属的珍禽养殖场，死亡和发病雉鸡，具有典型的巴氏杆菌病症状。

1.2 试验动物 21日龄未经禽巴氏杆菌疫苗免疫的健康雉鸡15只，由某珍禽养殖场提供。

1.3 疫苗 使用的禽霍乱油乳剂灭活苗、禽霍乱蜂胶灭活苗，采用分离鉴定的菌株常规方法制备；多杀性巴氏杆菌病活疫苗，为省兽医卫生防疫站提供。

1.4 试剂 革兰氏染料、瑞氏染料、糖发酵管和药敏试纸，营养琼脂培养基粉、麦康凯琼脂培养基粉、营养肉汤粉均购自杭州微生物试剂有限公司。参照文献设计如下1对引物，该引物扩增片段为457bp,上海生工生物工程技术服务有限公司合成p1:5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG -3;p2:5 -GCGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

2 方法

2.1 剖检变化与病理组织学观察 对发病死亡的雉鸡进行解剖检查，观察各脏器的病理变化。采集病变明显的心脏、肝脏、肺和脑等器官的组织，用10%福尔马林固定后，按常规方法进行病理组织切片的制作，及用光学显微镜检查各组织的病理变化。

2.2 病原的分离 病料的选取与细节分离，取刚发病死亡的雉鸡，经无菌操作从肝脏、脾脏和脑组织器官划线接种于鲜血琼脂平板上，经37℃恒温箱中培养24h,观察细菌生长情况。挑取单个疑似巴氏杆菌菌落，于鲜血琼脂平板上划线，然后进行纯化培养。

2.3 病原菌的培养特性及菌落形态观察 将纯化的培养物分别接种于鲜血琼脂平板上、麦康凯琼脂平板、普通营养琼脂平板、营养肉汤上，37℃恒温箱中培养24h，观察培养物在这3个平板及肉汤中的生长特点。取病死雉鸡肝脏、脾脏组织触片，分别经美兰染色和姬姆萨染色、镜检，观察细菌形态，并对分离菌纯培养进行涂片、革兰氏染色、镜检。

2.4 生化试验 对纯化好的可疑细菌进行生化试验；用葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸盐、MR、VP，进行观察。

2.5 药敏试验 采用纸片扩散法作药敏试验，对纯化好的可疑菌作药敏试验，操作方法和判定标准参照杭州天和微生物试剂有限公司的操作方法和标准。药敏纸片包括头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、氨苄青霉素、先锋霉素、阿米卡星、卡那霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明。

2.6 PCR检测 用接种环挑取可疑菌落和禽巴氏杆菌阳性标准菌株，分别悬浮于含50μl无菌水的离心管中，100℃水煮5～10min，然后迅速置于冰上冷却5min，10000r/min离心2min，分别取出上清液为PCR模板。采用25μl的反应体系；10xTap缓存液2.5μm，25mmo/LdNTPs0.5μm，20μmol/L上、下游引物各0.5μl，Tap DNA集合酶0.5μl，无菌水 10μl，模板 10μl。95℃反应 5min:95℃30s，56℃ 30s，72℃ 40s，进行 35个循环；最后 72℃延伸10min，产物于8℃短时间保存。取反应产物各10μl，于含EB的10g/L琼脂糖凝胶中，90V电泳30min，然后在紫外线下观察。

2.7 致病性试验 取6只20日龄未经免疫禽霍乱疫苗的雉鸡，肌肉注射分离菌经24h纯培养的菌液，1ml/只，观察发病情况，记录结果，对死亡雉鸡进行剖检与病原菌复制分离。

3 结果

3.1 病理变化 全身组织器官出现严重的败血症，肝脏表面有灰白色、针尖大小、边缘整齐的坏死点，有时融合成块状；心包积液，心内外膜严重出血；肺水肿、出血；气囊膜出血、壁增厚、发生水肿（带血、胶冻状）；肠管肿胀，充满带血内容物，粘膜脱落，严重出血；脾脏出现出血、坏死；腺胃出血、气管出现；肺上皮细胞变性坏死；肝细胞索断裂，空泡变性。肝血窦扩张，充满炎症细胞、红细胞、病原菌、肝细胞变性坏死；心肌细胞萎缩，间质增宽，充满大量红细胞。

3.2 涂片镜检 无菌操作采集病死的雉鸡心血制成涂片，同时将肝脏、脾脏和淋巴结病变组织制成触片，进行革兰氏染色，镜检，可见短小杆菌，两端钝圆；美兰染色时，可见典型的两极着色的短杆菌。

3.3 细菌分离与培养 从肝脏、脾脏和脑组织分离到的细菌，分离菌在鲜血琼脂平板上长出灰白色、半透明、表面光滑的露珠状小菌落，直径 1～2mm，不溶血，在普通琼脂平板上生长不良，在麦康凯平板上不生长，在肉汤培养初期呈均匀浑浊，24h后上清清亮，管底有灰白色絮状物沉淀。培养物涂片，革兰氏染色阴性，近似球型或双球型。组织触片，经姬姆萨、美兰染色可见到菌体呈明显的两极着色。

3.4 生化试验结果 分离菌发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甘露糖，不发酵棉子糖、乳糖和木糖，硝酸盐试验阳性，硫化氢、明胶试验阴性，根据生化特性判定为多杀巴氏杆菌。

3.5 PCR检测结果 用引物扩增时，分离的疑似菌落和Pm阳性标准均有扩增出目的条件，且大小基本一致，经多分离菌的可疑菌落 Pm阳性PCR产物回收测序，与NCBI上发布的序列对比，同圆性为98.8%。

3.6 药敏试验 采用纸片扩散法作药敏试验，结果分离菌株对头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、丁胺卡那霉素高敏，对复方新诺明、妥布霉素、新霉素中敏，对青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素不敏感。

3.7 致病性试验 试验雉鸡在攻毒后 24h内即出现死亡，48h内全部死亡，解剖后发现病变为：胸肌、腿肌出血严重；心脏肿大，心包积液，心脏有大的出血点或泼水样的出血点；脾脏萎缩；肝脏病变不明显；十二指肠弥漫性出血，雉鸡的毛容易拔出，血液凝固不全。接种疫苗的雉鸡期间未见死亡，72h对活雉鸡进行解剖，可见内脏有轻微病变。死亡雉鸡可见与自然病例相同的病理变化，并从死亡雉鸡的心脏、肝脏等器官中重新分离出攻毒菌。

4 小结与讨论

4.1 从发病死亡的雉鸡中，通过解剖病变、分离细菌培养、染色镜检、生化试验、PCR试验和致病性试验，分离到一株多杀性巴氏杆菌。由于珍禽场感染率高于分离率，说明铁力地区部分区域已感染禽巴氏杆菌，巴氏杆菌病作为禽的疾病，对养禽业威胁很大。目前，养殖场长期、大量使用抗生素进行猪病的预防和治疗，导致细菌的抗药性增强，往往引发混合感染或继发感染，导致对细菌的分离培养难度加大，使珍禽场治疗效果也越来越差，因此，养禽场应引起对雉鸡的重视。

4.2 从本试验结果来看，可疑菌落培养物攻毒在24h内死亡，通过采集死亡雉鸡脏器，再次进行细菌分离鉴定试验，结果与本次试验结果相同，说明本次分离的雉鸡巴氏杆菌具有较强的感染率。

4.3 从药敏结果来看，分离到的巴氏杆菌具有较强的致病性，对头孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林和丁胺卡那高敏，但对青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和复方新诺明常用药物产生抗药性。说明这些常用药物由于在临床上长期使用，已形成严重的耐药性，应该引起养殖者的注意。在有条件的情况下，可通过药敏试验筛选出高效的药物进行治疗，制定合理的治疗方案，如轮换用药、控制剂量和疗程。

4.4 试验表明，应用敏感药物结合紧急疫苗接种，在短时间内有效控制了该病的发生，但在实际生产中禽巴氏杆菌不能依赖于疫苗接种，更重要的是加强饲养管理、兽医卫生工作，建立完善的卫生消毒制度，坚持以防为主、防治结合的方针，这样才能很好地控制巴氏杆菌病的发生。

4.5 本试验设计的PCR引物，可直接从第1代培养皿上可疑菌做PCR检查，无需提供细菌的基因组，最小检查禽巴氏杆菌病原CFU为103/ml,检测结果若为阳性，一般可分离出Pm，若为阴性则反之，耗时只需几小时，与传统的分离培养及鉴定相比，PCR检测大幅提升了该病的诊断速度，避免费时、费力、漏检、错检等不足，显示了PCR技术对疾病的早期诊断、及时治疗，对减少经济损失具有重要意义。

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S858.394.4

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2017-01-22