分子生物学技术在转基因食品检测领域中的研究进展

沈 泓，李 超，李 珏

（浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052）

分子生物学技术在转基因食品检测领域中的研究进展

沈 泓，李 超，李 珏

（浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052）

近年来，随着基因工程技术的发展，转基因食品也随之快速发展起来，但转基因食品在为人类带来巨大经济效益的同时，也存在着安全隐患。因此，高效、便捷的转基因食品检测技术显得至关重要。文章从基因水平、蛋白质水平两个方面，介绍了多种转基因食品检测技术，并对这些方法的基本原理、优缺点及存在的问题等方面进行了具体分析。

转基因食品 检测 基因 蛋白质

转基因食品（Genetically Modified Food）是指利用基因工程手段，将一些有利于人类生产的外源基因转入动物、植物或者微生物中，改变其遗传特性，从而获得原物种所不具备的性状、营养价值、品质特征[1]。因此，转基因食品又可分为转基因植物、转基因动物、转基因微生物食品[2]。从1983年P. Zambryski等用T载体将外源基因转入植物细胞基因组从而得到第一株转基因植物以来[3]，转基因食品的研究与应用越来越受到关注。转基因油菜、玉米、棉花、南瓜等几十个农作物品种被相继开发，这些转基因作物具有抗除草剂、抗虫、抗病毒等多种不同性状的外源基因[4]。

然而，虽然转基因食品的逐渐商业化为满足人们日益增长的物质需求提供了新的途径，但转基因食品在食用安全性、对生态环境的影响等方面一直颇受争议[5]。转基因食品是利用基因工程改变原物种遗传物质的新技术，转基因过程中的各个环节都有可能产生安全隐患[6]，例如经过DNA重组后的物种可能会合成具有毒性的蛋白质；转基因物种所表达的蛋白可能会影响人的免疫系统等。我国是转基因作物种植大国，种植面积位居世界第六。同时，我国也是转基因食品进口大国，研究显示我国进口转基因大豆累计达2亿t，市场上70%的豆制品中含有转基因成分[7]。因此，建立高效、快速、准确的转基因食品定性、定量检测方法，是满足广大消费者知情权和选择权的需要，更是加强转基因食品安全监管的重要技术支撑[8]。该文主要对目前分子生物学技术在转基因食品检测中的应用进行详细阐述。

1 基因水平的检测

转基因技术是指通过基因工程手段对生物体内DNA分子进行修饰改造从而改变原物种遗传性状。基因水平的检测主要是利用PCR法、分子杂交、基因芯片等方法检测遗传物质中是否存在外源基因[9]。

1.1 基于PCR的检测方法

1.1.1 定性PCR法

为了使外源基因能被顺利转入宿主体内并有效地表达，转基因一般需要构建启动子、终止子、选择性标记基因、报告基因[10]，其中启动子和终止子是目的基因表达必不可少的序列。据研究，绝大部分转基因作物含有启动子CaMV 35S、终止子NOS和抗性基因NPTII3这3个基因元件。针对启动子、终止子、选择性标记基因等设计引物，通过PCR扩增这些序列，可鉴定出食品中是否含有转基因成分[5]。国内，倪贤生等利用花椰菜花叶病毒35S启动子和根瘤农杆菌NOS终止子设计了特异性引物对35S、NOS，以PCR扩增技术成功检测出转基因大豆。国外，Shirai等[11]用该方法成功检测了抗草甘膦的转基因大豆Rounfup Ready。但定性PCR法只是对转基因产品的初步检测，某些植物或土壤微生物中也会含有CaMV 35S和NOS基因元件，因此该方法有假阳性的可能。

1.1.2 多重PCR法

多重PCR技术，又称复合PCR技术，是1种在1个PCR反应体系中加多对引物，同时扩增多个靶序列的技术。常规PCR技术由于受到引物的限制，1次只能检测1个目的片段，如需要检测多个目的片段则需要进行多次PCR检测。而多重PCR法可通过1次扩增，检测多个靶基因片段，相较于常规PCR法既节约成本，又大幅提高检测效率，其检测效果也更为可信[12-13]。目前多重PCR技术已用于多个转基因作物品种的检测，且随着对定量检测的需求，该技术也被发展用于定量检测。2005年，Hiroshi Akiyama等[14]成功将多重定量PCR技术应用于拥有不同性状的转基因玉米的检测。张平平等[15]以大豆外源凝集素基因和肌动蛋白基因作为内部对照以评价多重PCR反应的效率，结果显示当转基因大豆含量仅为0.15%时，仍可以对转基因食品进行可靠的鉴定。

1.1.3 实时荧光定量PCR法

实时荧光定量PCR在常规PCR法的基础上增加了一条带有荧光基团的探针，其5’端带有1个报告基团，3’端带有1个淬灭基团。反应开始时，探针结合在目的基因上；随着扩增链的形成，DNA聚合酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增1条DNA链，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而对反应管中的荧光度进行实时检测，确定反应出的DNA的量，然后通过计算机程序对获得的数据进行处理来给出样品中DNA的量[16]。蔡慧农等[17]将TaqMan探针应用于荧光定量PCR，成功建立了转基因大豆和转基因玉米的TaqMan-荧光定量PCR检测方法。荧光定量PCR法具有污染风险小、灵敏度高、操作简单、检测时间短等优点。但该方法设备昂贵，单次检测成本相对较高[18]。

1.2 基于基因芯片的检测方法

基因芯片（Gene chip）又称DNA微阵列（DNA microarray），是一种将大量带有标记的基因寡核苷酸探针按特定排列方式固定于尼龙膜、硅片、玻璃等载体之上[19]，可与靶基因片段进行分子杂交，并通过扫描仪系统）检测分子杂交信号强度，然后以计算机技术对信号进行综合分析，即可获得样品中大量基因序列及表达信息，以对其进行定性及定量[5]。在食品安全领域，基因芯片技术主要被应用于食源性致病微生物快速检测和转基因食品的检测。黄文胜等[20]根据目前油菜种所转入的外源基因，以CaMV35S启动子、FMV35S启动子、Nos终止子、Bar、Barnase、Barstar、EPSPS、GOX、PAT和内源基因Fbp等为靶序列，设计特异性引物和探针，并制备相应的基因芯片，结合多重PCR技术用来检测油菜样品中所含的外源基因，1次可同时检测10个基因，具有独特的优势。

2 蛋白质水平检测

生物遗传信息的传递是遵循“中心法则”的，遗传信息由DNA转录成RNA，再通过RNA在核糖体中的翻译合成对应的蛋白质，用以维持生物体各项生理功能。转基因技术的目的是通过改变生物体DNA，使其表达人们所期望的特异蛋白质。因此，针对转基因产品中外源基因所表达的特异性蛋白进行检测，也可准确的鉴定出转基因成分。目前，蛋白质水平上用于转基因检测的方法主要有Western印迹法、酶联免疫吸附法、试纸条法、蛋白质芯片等。

2.1 Western印迹法

蛋白质印迹法与分子杂交原理相似，是一种结合电泳分离、特异性抗体、显色酶促反应的技术，能够从相对复杂的混合物中检测出特异性蛋白质。蛋白质印迹法主要是从待测样本中提取总蛋白，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子质量大小分离后，将其转移到固相支持物（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，用同位素标记的抗体作为探针进行杂交，再通过放射性显影技术检测出食品中的转基因成分[5]。该技术目前已被用于致病菌、转基因食品的检测领域，利用该方法可从植物细胞总蛋白中检测出50 ng的特异性蛋白质，若总蛋白纯度高可检出1～5 ng[1]。据报道，蛋白质印迹法成功检测了Roundup Ready大豆中的CP4合成酶，且检测限达到了0.5%～1.0%[21]。但蛋白质印迹法操作过程复杂，操作时间较长，导致该技术无法成为一种高效的转基因食品检测方法。

2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）

酶联免疫吸附法又称为酶标法，是在免疫酶基础上发展起来的新型免疫检测技术，它将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合了起来。ELISA的基本原理是用固相载体吸附检测样品和抗体或抗原，将其与相应的美标抗体或抗原进行特异性反应形成抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，加入酶底物后发生显色反应，待测抗原的量与显色产物成正比，因此可通过分析有色产物的量确定样本中待测物的含量[22]。ELISA技术要求低，操作简便准确，已发展成为1种应用广泛的检测技术手段。目前在转基因食品检测领域，已有多种商业化ELISA检测试剂盒。但ELISA技术也有其缺点，就是检测通量低，且1种试剂盒一般只可检测1种特定的转基因产物，检测成本相对较高[8]。

2.3 蛋白质芯片

蛋白质芯片技术在原理上与基因芯片技术大致相同，将蛋白质检测试剂或检测探针以阵列形式固定在玻片、硅片、纤维膜等固相载体上，将从待测样品中提取的总蛋白与蛋白芯片进行孵育反应，带有荧光标记的靶蛋白分子与芯片中的分子发生特异性反应，通过对荧光信号强度进行检测，可判断食品中是否含有待检的目标蛋白及其含量，由此推断食品中是否含有该蛋白对应的转基因成分及其含量[5]。汪琳等[23]建立了1种抗体蛋白芯片检测方法，可同时检测BT Cry1Ac 蛋白、植酸酶蛋白、BT Cry1Ah 蛋白的这3种转基因成分。蛋白质芯片技术有着特异性强、检测效率高的优点，但也有着一些需要解决的问题，如芯片制造成本相对较高，固定于载体表面特异外源蛋白容易失活，灵敏度低等。

2.4 试纸条法

试纸条法主要是将特异性抗体交联到试纸条和显色物质上，当试纸条上的特异性抗体与抗原物质结合后再与带有显色物质的抗体发生免疫反应，形成双抗夹心结构并在纸上显色，若不含有抗原则不显色。可根据转基因食品中所包含的外源性蛋白设计相应抗原，制备检测试纸条。该法操作简便，成本低廉，且不需要仪器设备，非常适用于现场检测。但试纸条法也存在着些许不足，如检测灵敏度低，当转基因食品中外源基因表达量低时，无法进行有效检测；经过加工的转基因食品其蛋白质结构容易受到破坏，从而影响检测结果的准确性[24]。

3 结语

随着基因工程的快速发展，越来越多转基因食品流入市场，转基因食品在满足各种特定需求的同时，其安全性也越来越受到人们关注。对转基因食品进行有效标识和合理监管的前提就是要对转基因食品进行有效检测。因此，建立起快速、准确、简单、高效的、适用性广的转基因食品检测技术至关重要。核酸、蛋白质等大分子物质是特异性检测转基因食品的理想物质，随着分子生物学技术的发展，转基因检测技术也有了极大的发展。除了该文介绍的技术，还有许多从分子水平出发检测转基因的新技术，如巢式和半巢式PCR[25]、生物传感器技术[26]、PCR-ELISA法[27]、免疫PCR法[28]等。转基因食品检测方法多种多样，但所有的方法都各有优缺点，需要不断完善和改进。随着技术的进步，会有更多先进的转基因食品检测技术出现。

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