荧光定量PCR检测宫颈癌患者血清中miR-203表达水平价值分析

miR-203是一种特异性皮肤miRNA，其可以对胚胎期的表皮分化、皮肤保护层构建进行参与和调控，且与牛皮癣、银屑病等皮肤性疾病有关，能够作为致癌或抑癌因子参与癌细胞的分化增殖、侵袭转移以及凋亡中[1]。相关研究表明，miR-203发生异常表达主要与结肠癌、食管癌、白血病（慢性粒细胞）、前列腺癌等肿瘤的发生以及发展有关。宫颈癌是一种妇科恶性肿瘤，其发病率与死亡率均较高。宫颈癌的发生、发展以及其疾病转归较为复杂，是对基因调控异常的一个过程。宫颈癌患者的肿瘤细胞中沉默表达或低表达的抑癌性miRNA能够以其表达载体系统或类似物将外源miRNA导入，从而对肿瘤细胞的生长进行抑制，预防和治疗宫颈癌[2]。本文主要对荧光定量PCR在宫颈癌患者血清miR-203表达检测中的应用价值作分析，如下文。

1 资料与方法

1.1 基本资料

选取2016年1—12月宫颈癌患者60例作为实验组，同时选取良性宫颈疾病患者60例为对照组A，选取健康体检女性60例作为对照组B，其均接受血清荧光定量PCR检测。实验组中，年龄范围为25～50岁，年龄均值为（38.51±1.20）岁；本组患者均经病理诊断确诊，临床资料完整，且为初次治疗的病例，将合并其他原发恶性肿瘤的患者排除。对照组A中，年龄范围为24～51岁，年龄均值为（37.58±1.32）岁，其中子宫肌瘤患者21例，子宫内膜增厚患者23例，子宫内膜异位症患者13例，其他疾病患者3例。对照组B中，年龄范围为25～52岁，年龄均值为（38.01±1.36）岁。三组组受检者进行基本资料对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 仪器、试剂 仪器主要包括紫外分光光度仪、高速冷冻离心机、低温冰箱（-80℃）、7500 Real Time PCR System、PCR八连管；试剂主要为Trizol（DNA提取试剂）、逆转录试剂、DNA引物、miR-203与miR-let7、Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）、TIANGEN普通型 miRNA、poly（A）尾、荧光定量试剂盒（KR201/FP401）、miRNA外参上游检测引物（CD200）等。

1.2.2 标本采集 通过真空管（分离胶）对受检者的血液标本进行采集，并进行离心处理，离心速度为每分钟1 000转，离心处理时间为10 min，之后取上清液置于EP管（含Rnase-free）中，在-80℃的温度下保存。

1.2.3 提取血清RNA 采用RPE、RWT、QIAzol试剂和吸附柱对血清RNA进行提取，将其溶于nuclease-free H2O（40 μl）中，采用紫外分光光度仪对RNA的纯度和浓度进行计算，并通过相关的模板进行逆转录反应。

1.2.4 cDNA合成 将500 ng RNA、nuclease-free H2O等逆转录反应体系进行混匀，并进行离心处理，反应条件是42℃下60 min，在70℃下为5 min，将获得逆转录产物放置于-20 ℃中进行保存。

1.2.5 实施荧光定量PCR 其反应的体系主要为5 μl cDNA，9 μl SYBR Green Ⅰ mix（Rox）、2 μl上游引物和 2 μl下游引物，合理对miR-203、miR-let7正向引物序列和反向引物序列进行设计，将RNnuclease-free H2O补足至20 μl，其反应的条件是95℃下为10 min，之后95℃下15 s，在60℃下为60 min，共计40个循环，在60℃～95℃的条件下对荧光绘制的溶解曲线进行收集。

1.3 观察指标

对三组受检查者荧光定量PCR检测的miR-203结果进行观察分析。

1.4 统计学处理

本文研究通过Ct值法进行对比，取两项平行反应的均值Ct值，△Ct=Ct（miR-203）-Ct（miR-let7），基因相对表达量通过2-△Ct方法计算。所有资料用Graphpad Prism 5软件实施统计学的分析。

2 结果

miR-203的熔解度在79.56℃左右，内参miR-let7熔点温度在72.12℃左右，表示PCR参数设置合理，其逆转录引物以及扩增物能够将miR-203以及内参miR-let7片段扩增出，非特异性产物对PCR检查结果的相关影响较小，具有较高的特异度。

miR-203荧光定量PCR的反应曲线主要为S型，其中实验组的Ct值均值为（17.21±2.02），对照组A的Ct值均值为（22.35±2.30），对照组B的Ct值均值为（23.10±2.18），实验组宫颈癌患者的Ct值明显低于对照组A宫颈良性疾病患者和对照组B健康体检女性（P＜0.05）。两组之间的Ct值相比，差异较小（P＞0.05）。

3 讨论

宫颈癌患者在疾病早期接受放射或手术治疗，对改善其预后有着积极的意义。但是若患者存在淋巴结为转移的情况，则临床为其实施早期诊断时较易出现漏诊的情况[3-4]。目前，对于淋巴转移进行检测的方法主要为CT、PET-CT、MR等，但是其特异性和敏感性均较低[5-6]。

随着研究的不断深入，人们发现在血清中存在较多不同组织中的miRNA，有学者认为miRNA可以作为一种潜在肿瘤标志物，在淋巴细胞癌患者中，其血清miR-21、miR-210、miR-155等的表达量均明显高于健康者[7]。大量研究证实miRNA能够作为多种癌症鉴别诊断的辅助手段，是患者病程监测以及预后评价的标志物[8]。膀胱癌、肺癌、胰腺癌等患者血清中的miR-203均处于高表达的状态。相关研究发现，miR-203与miR20a与宫颈癌患者的疾病转移、侵袭有着较为密切的关系，加强miR-203的检测对宫颈癌患者疾病的诊断和预后的评估有着积极的意义。荧光定量PCR在miRNA检测中应用，具有敏感度高、快速简便、特异度高等特点，具有较高的应用价值。

综上所述，血清miR-203在宫颈癌患者疾病发生和发展过程中起着十分重要的作用，通过荧光定量PCR对miR-203进行检测，能够对宫颈癌患者疾病的早期诊断和治疗提供依据，意义重大。