规范疟原虫检测 助力疟疾消除—《疟原虫检测 血涂片镜检法》标准编制背景与解读

王善青 周晓农

1 制定《疟原虫检测 血涂片镜检法》的意义和必要性

血涂片染色法检测技术是目前国内外通用的最直接、最重要的疟原虫检测方法和疟疾病例确诊依据。血涂片镜检法既是世界卫生组织推荐的疟原虫检测金标准，也是我国疟疾诊断标准中推荐的主要检测技术。世卫组织建议，在进行抗疟治疗之前，要对所有疟疾疑似患者通过显微镜或者疟疾快速诊断检测法（RDT）及时作出寄生虫学诊断[1]。光学显微镜要求在患者血液的厚涂片或者薄涂片中看到疟原虫。2016年6月1日起实施的《疟疾的诊断》标准（WS-259-2015）中，在实验室检查中的第一条就是显微镜检查血涂片查见疟原虫[2]。目前，国内外检测疟原虫的主要方法就是“血涂片染色镜检法”。通过镜检方法检测的疟疾患者数量在2014年全球上升到2.03亿。印度在这一全球总量中占据主导，所做的载玻片检查达到1.2亿份以上。在非洲区域，通过显微镜得到检查的患者人数由2010年的3 300万增加到2014年4 800万[3]。镜检诊断检测可加强对发热患者中疟疾患者的筛查和管理，也可能有助于通过仅在确诊患者身上使用抗疟疾药而减轻耐药性的出现和扩散。

血涂片染色后用显微镜检测疟原虫是我国基层医疗机构和疾控部门最直接也是最常用的检测方法[4]。血涂片显微镜检查疟原虫是医学上一种比较常见的方法，并且这种方法在对疟原虫的检查上运用的非常广泛，对于疟疾患者的及时诊断有着很大的临床价值。血涂片镜检疟原虫也是检验科的基本技能之一[5]。由于我国目前对于显微镜血涂片检测疟原虫技术只有指南，而没有规范标准。各地在实际操作过程中很难做到统一标准，基层医疗卫生工作者在开展显微镜血涂片法检测疟原虫时随意性很大，血涂片的制作既不规范也不统一。近年来，由于我国本地疟疾病例的减少和消除，导致许多基层医院和疾控机构不再重视疟疾血涂片的镜检工作，使好多年轻的检验工作者不会制作血涂片，不认识疟原虫，导致基层检测人员的血涂片镜检水平不断下降[6-8]，甚至各级疾控机构镜检人员疟原虫监测检测能力和意识也有所下降，这将会导致部分疟疾患者漏诊和误诊[9]，因为疟疾的早期准确诊断对于有效的疾病管理和疟疾监测至关重要，如果没有规范的显微镜血涂片法检测疟原虫技术标准，将直接影响到目前我国正在开展的消除疟疾工作中的病例诊断和发热患者的监测。因为误诊会引起大量发病和死亡，高质量的疟疾诊断在各种情况下都很关键。因此，制定《疟原虫检测 血涂片镜检法》这一标准，是为我国各级医疗机构从事临床疟疾病原学检验人员和疾控机构从事疟疾监测实验室人员提供一个统一规范的操作流程和技术规范。该标准的制订对我国消除疟疾以及消除疟疾后的监测工作具有十分重要的意义。镜检疟原虫仍是目前疟疾诊断的金标准，是发现疟疾病原的主要手段，也是当前防治和消除疟疾工作中的关键技术之一[10]。2010年，原卫生部等13部委联合印发了《中国消除疟疾行动计划2010-2020》[11]，确定了到2020年全国实现消除疟疾的目标，并对各级疾病预防控制机构开展疟原虫血检比例、实验室检测率和实验室确诊比例等指标作了明确规定。为进一步提高全国疾控机构专业技术人员寄生虫病防治理论水平与检测技能，提高各地重点和常见寄生虫病防治能力，国家卫生计生委疾控局每年都要举办全国寄生虫病防治技术竞赛，其中一项重要内容就是血涂片制作、染色及镜检操作等技能。有了标准，全国就有了统一的规范和要求，对人员培训、考核与评价也就有了依据。

2 血涂片镜检法检测疟原虫的优势与条件

光学显微镜的优点是在患者血液的厚涂片或者薄涂片中可以直接看到疟原虫。显微镜使人能够辨认不同的致疟寄生虫（恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫）、寄生虫不同时期（包括配子体），以及对寄生虫密度进行定量，以监测治疗效果。显微镜是对疟疾治疗失败情况作出调查的首选方法。吉姆萨染色是显微镜检测疟原虫所用的传统染色方法，要对同一患者的薄血膜和厚血膜进行检查才可做出诊断。血涂片镜检法是从传统角度对其它诊断方法进行衡量的诊断标准，所以说目前仍然是疟疾诊断的金标准。

对疟疾实行寄生虫学诊断检测可以加强对发热疾病患者的管理，特别是有助于发现需要不同治疗方法的非疟疾患者。使用这种检查方法可以仅在确诊患者身上使用抗疟药，从而有助于减少耐药性的出现和扩散。寄生虫学诊断的优势取决于医疗机构是否在管理患者时遵循检查结果。在可以及时进行高质量的寄生虫学诊断，而且没有严重疾病征兆时，抗疟药治疗应该仅限于检查结果呈阳性的病例，而阴性病例则考虑其它发热病因。

虽然显微镜仍然是多数大型医疗诊所和医院作出寄生虫学诊断的支柱，但显微镜诊断的质量常常在确保疟疾诊断的良好敏感性和特异性方面存在不足，这对健康结果和最佳治疗方案带来了负面影响。可接受的显微镜检测应该既符合成本效益，又可以一直得出准确并且足够及时的结果，以对治疗带来直接影响。这就需要有全面并且运作良好的质量保证规划[3]。疟疾镜检方面的有效质量管理体系要求有：（1）对质量保证进行监督的中央协调员；（2）在国家级和省级层面有一支显微镜学家参考（核心）小组，并得到外部质量保证规划的支持以及得到培训和载玻片验证方面的专门技能；（3）根据相关临床机构所需能力建立起良好培训系统；（4）定期开展再培训并对能力进行评估/分级，同时得到经过验证的参比成套载玻片（疟疾载玻片银行）的支持；（5）可持续的载玻片验证系统，可利用良好的验证结果来发现存在的总体不足，并具有一个解决绩效不足问题的系统；（6）在所有层面实施良好监督；（7）对显微镜进行良好的供应管理和维护；（8）在所有层面具有清晰的标准操作程序；（9）将预算列入疟疾病例管理资金并使其保持充足。

3 世界卫生组织的相关文件和手册指南

世卫组织要求所有疑似疟疾患者在接受抗疟药物治疗前，应先进行实验室检查（显微镜血涂片检查或疟疾快速诊断试剂检测）。世界卫生组织（WHO）在2010年出版的《疟疾治疗指南》（Guidelines for the treatment of malaria, Second edition，WHO，2010）中明确指出，血涂片染色法检测疟原虫是疟疾诊断基本方法[12]，在2013年版《普及疟疾诊断检测-操作手册》（Universal access to malaria diagnostic testing：an operational manual，WHO，2011，rev.2013）中，不但将显微镜血涂片染色法检测疟原虫列为两个基本诊断检测方法之一（另一个是RDT），而且还列出了显微镜的使用、维护与保养标准操作规程[13]。虽然RDT越来越多地用于疟疾的诊断，特别是在没有镜检能力的偏远山区，但是，由于显微镜血涂片染色法检测疟原虫具有直接成本低、能区分多种种型和计算原虫密度等独特优势，RDT是无法取代的，由此，WHO和世界各国目前仍推荐显微镜血涂片染色法检测疟原虫为疟疾诊断检测的基本方法，特别在消除疟疾阶段，WHO推荐显微镜血涂片检测是发现病例的主要手段，并于2014年3月在日内瓦召开了“全球疟疾项目专家咨询会”专门讨论了疟疾镜检质量保证手册的更新问题[14]，2015年又出台了厚薄血膜用于疟原虫的发现、诊断和计数的显微镜使用手册[15]，指导世界各地疟疾流行区的疟原虫显微镜检测工作。

4 血涂片镜检在检验人员全面素质培训中的重要性

随着各类仪器在检验工作中的应用，仪器操作简便、准确度高、误差小等优点越来越被广大检验工作者所青睐，也越来越依赖这些仪器。再加上现在工作量大，费时、费力的各种手工操作技术被忽略，而血涂片镜检就是各种手工操作技术中最基础的一项，也是考察检验工作者全面素质最标准的一项。而这些手工操作技术是很多仪器不能代替的，并且在其它血液检测标本预处理时也用的上[16]。为了加强血涂片镜检等检验基本操作技术，国家每年组织一次全国寄生虫基本操作技能比赛，引导着全国各地从事寄生虫检验（包括疟原虫检测）的人员学习推片、白细胞计数、观察各种寄生虫的形态等，使许多年轻同志熟练掌握了血涂片镜检的各种操作技术，提升了检测人员的全面素质。由于各类仪器的局限性，均不能对疟原虫的形态、分类及虫种等作出辨认，只能作为一种初筛手段。而血涂片镜检由于是在显微镜下直观观察，能提高对疟疾的诊断准确度，更好地服务于临床，服务于患者。各级医院应高度重视血涂片镜检工作，制定完善的制度。同时做好检验工作者全面素质的培训，提高检验工作者服务于临床的基本操作技能[17]。

5 对可能引起误解的指标的解释

（1） 厚血膜的直径应为0.8～1 cm 还是1～1.2 cm，标准中规定的是直径0.8～1 cm，主要依据一是2015年11月16日发布的《疟疾的诊断》（WS259-2015）规范性附录中已有明确要求，二是现场调研时征求了县乡两级疟疾检验人员的意见，认为直径0.8～1 cm的厚血膜是合适的。

（2） 厚血膜一天内染色无需溶血,“一天”是否应改为“24小时”，经专家会议讨论和现场调研了解，大家一致认为厚血膜溶血虽然有时间要求，但是不用精确到小时，为了便于基层人员掌握，以“一天”的描述方式较为合适。

（3）制作薄血膜时，载玻片与推片保持25°～35°角还是30°～45°角推开血膜，本标准中规定的是载玻片与推片保持25°～35°，主要依据一是2015年11月16日发布的《疟疾的诊断》（WS259-2015）规范性附录中已有明确要求，二是现场调研时征求了县乡两级疟疾检验人员的意见，认为载玻片与推片保持25°～35°是合适的。

（4）关于是否要增加“诺氏疟原虫”这个问题，起草组专家进行了认真的讨论，最后一致认为，尽管目前国外（特别是马来西亚和一些东南亚国家）有不少人感染“诺氏疟原虫”的报道，国内也有检测到个别“诺氏疟原虫”感染病例，但是，目前国际社会仍以四种人体寄生虫为主，尚未把“诺氏疟原虫”正式纳入，另外，本标准在术语的定义中表述的已经比较清楚，将其纳入“等”的范围。