“土贡松”母树林种子品质与遗传多样性初步分析

聂永雄，韦 勋，张 荣，张海东，周梓富，白天道*

(1.国营苍梧县天洪岭林场，广西 苍梧 534100；2.广西大学林学院，南宁 530004)

“土贡松”母树林种子品质与遗传多样性初步分析

聂永雄1，韦 勋2，张 荣1，张海东2，周梓富1，白天道2*

(1.国营苍梧县天洪岭林场，广西 苍梧 534100；2.广西大学林学院，南宁 530004)

种子品质及遗传多样性是评价良种生产群体优劣的重要指标。本研究对广西55a生“土贡松”母树林种子表型及生活力、性状间相关性、子代遗传多样性等进行了分析研究，表明：不同采种母树在种子表型性状(种子长、种子宽、种翅长、种翅宽、种子长宽比、种翅长宽比、千粒重)及种子生活力(萌发率、胚根长度)上均存在极显著差异(P\%<0.0001);不同母树种子的萌发率在47%～95%之间;种子表型性状与种子生活力性状无显著相关性;母树林具有较广泛的遗传基础，基因期望杂合度、Nei期望杂合度分别为0.602、0.588;林内个体间存在明显的授粉不随机现象(观察杂合度0.381<期望杂合度0.602)，可能存在一定程度近交或自交。

“土贡松”；母树林；种子品质；遗传多样性

马尾松(Pinusmassoniana)是中国主要用材树种之一，广泛分布于中国南方十多个省市。广西是马尾松优良种源区，其马尾松主要分布于广西东部和南部地区。马尾松土贡种源位于广西东部梧州市苍梧县，其生长表现优良，其生长量均高于相应立地国家马尾松速生标准，当地群众称为“土贡松”[1]。2013年“土贡松”被列为广西马尾松良种[2]。

林木种子品质的好坏，直接关系到育苗和造林的成败，种子品质评价对良种生产及人工造林具有重要指导作用[3]。“土贡松”作为广西马尾松优良种源，一些文献在其人工林生长[1]、生物量[4]、产脂力[5]、营养元素分配[6]及木材特性[7]等方面进行了报道，但在良种生产群体的遗传基础(遗传多样性)及种子品质方面的研究还极为欠缺。本研究利用位于广西东南部的一片55a生“土贡松”母树林作为研究材料，初步分析该林分作为良种生产群体所获得的种子的生活力及遗传多样性水平，以为该母树林的进一步选择及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于广西苍梧县北部天洪岭林场土贡分场，地理坐标为东经111°15′，北纬23°41′ 。属于亚热带季风气候区，光照充足，雨量充沛，年平均气温约21 ℃，极端最高温、最低温分别为39℃、3℃，年均降水量1503.6mm，年均相对湿度为78%。土壤类型为地带性红壤，土壤肥力中等。平均海拔约350m，坡度在11～38°之间。

1.2 试验材料

试验材料为天洪林场55a生“土贡松”采种母树林，造林时间为1959年，种子来源为“土贡松”天然林分混合种，采用裸根苗造林，初始株行距1.7m×1.7m，林分面积2hm2。先后进行了多次去劣疏伐，目前保留密度400～450株·hm-2，林分平均胸径45.31cm，平均树高为30.06m。

1.3 研究方法

1.3.1 母树林种子品质测定 ①球果采集与脱粒：于2014年10月在母树林中分别随机采集6株采种母树的球果，每株母树随机采集20个球果，球果脱粒采用削鳞去脂→曝晒脱粒→过筛净种的方法。②种子表型性状测定：利用电子游标卡尺分别测定种子长、种子宽、种翅长、种翅宽进行测定，每株母树随机测定100粒种子。③种子千粒重测定：将种子去除种翅，采用四分法抽取测定样品，重复4次，每次从样品中取200粒于电子天平上称重，换算为千粒重。④种子萌发率测定：将种子用蒸馏水浸泡12h后置于发芽盒内的湿润滤纸上，放入恒温光照培养箱中进行培养，每株母树4次重复，每重复100粒，定期观察种子发芽情况并记录。待发芽试验结束，测量胚根萌发长度，并计算萌发率，萌发率计算参见GB2772-1999。

1.3.2 遗传多样性评价 利用改良CTAB法[8]提取“土贡松”2a生苗木(从母树林采集的混合种子育苗)针叶DNA(24株)，采用7个SSR分子标记(表1)分别对每个植株进行基因分型。DNA提取及基因分型方法参见倪州献等[9]的文献。

表1 参试的7个SSR标记引物序列

1.4 数据处理与分析方法

采用Excel2013录入种子表型及生活力测定数据，运用SAS9.3进行数据方差分析及相关分析。等位基因数目(Na)、有效等位基因数目(Ne)、Shannon多样性指数(I)、多位点观察杂合度(Ho)及期望杂合度(He)、Nei’s基因多样度(Nei)等遗传多样性评价指标利用Popgene(v1.32)软件计。

2 结果与分析

2.1 采种母树种子性状变异分析

对母树林种子性状进行测定(表2)，发现不同母树间在种子表型性状及生活力上均存在一定的变异，参试性状的变异系数在4.89%(种子长宽比)～47.41%(胚根长度)之间。母树间在种子长(LS)、种子宽(WS)、种翅长(LW)、种翅宽(WW)、种子长宽比(RLS-WS)、种翅长宽比(RLW-WW)、千粒重(WTS)、萌发率(GR)及胚根长度(LR)上，最大值分别是最小值的1.16、1.13、1.24、1.19、1.23、1.14、1.84、2.01及3.81倍。

表2 “土贡松”采种母树种子各参试性状变异

方差分析表明(图1)，不同母树间在种子长(F=57.37, P<0.0001)、种子宽(F=40.17, P<0.0001)、种子长宽比(F=26.14, P<0.0001)及千粒重(F=439.00, P<0.0001)上均存在极显著差异。同时，母树间在种翅长(F=31.79, P<0.0001)、种翅宽(F=42.51, P<0.0001)、种翅长宽比(F=38.99, P<0.0001)上也差异极显著(图片未列出)。在种子生活力上，“土贡松”不同母树在种子萌发率(F=8.66, P<0.0011)及胚根长度(F=196.95, P<0.0001)上同样存在极显著差异(图2)。表明该母树林内不同母树生产的种子在表型性状及生活力上均存在明显差别。比如在种子萌发率上，1号母树为95%，而3号母树仅为47%。据此可初步推测，当前该母树林生产的种子的品质并不一致，存在优劣混杂的现象。就参试母树来看，1号母树在各个测定性状上表现相对较优，尤其是在种子长度、种子宽度、千粒重、萌发率及培根长度几个重要性状上均优于其他母树的种子。

图1 “土贡松”不同母树种子长(LS)、种子宽(WS)、种子长宽比(RLS-WS)及千粒重(WTS)性状差异

图2 “土贡松”不同母树种子萌发率(GR)及胚根长度(LR)差异

2.2 种子性状间的相关性分析

参试性状相关性分析结果显示(表3)，绝大多数性状间不存显著的相关性，尤其值得注意的是，萌发率与种子大小(LS、LW)、重量(WTS)并无显著的相关性。仅种子长度(LS)与千粒重(WTS)存在极显著正相关，萌发率(GR)与胚根长度(LR)存在极显著正相关，萌发率(GR)与种翅宽(WW)显著相关，种子宽(WS)与种翅长宽比(RLW-WW)存在显著负相关。

表3 “土贡松”种子性状间的相关性

2.3 母树林子代遗传多样性

对母树林子代进行遗传多样性分析，7个SSR位点均扩增出清晰稳定的条带(图3)，多态位点百分率达100%，检测到子代群体平均观察等位基因数(Na)为2.857，有效等位基因数(Ne)为2.594，观察杂合度(Ho)为0.381，期望杂合度(He)为0.602，Nei\%期望杂合度为0.5881(表4)。

7个SSR位点中有6个位点固定指数均大于零(表5)，表明群体在多个位点存在杂合子不足，推测该林分存在自交或近交现象。

图3 标记Pma.43在24个“土贡松”子代中的扩增结果

位点NaNeIHoHeNeiPma.4332.84441.070.50.66220.6484Pma.4521.81610.64160.50.45980.4494Pma.2232.17870.89490.250.55850.541Pma.2543.95881.38120.58330.76330.7474Pma.6632.90911.08220.41670.67020.6562Pma.7232.61221.02390.41670.63030.6172Pma.1921.84080.649200.47060.4567平均2.85712.59430.96330.3810.60210.5881标准差0.69010.74940.26160.19750.11140.1105

注：Na-观察等位基因数，Ne-有效等位基因数，I-香农多样性指数，Ho-观察杂合度，He-期望杂合度，Nei-Nei’s期望杂合度。

表5 参试位点固定指数

3 结论与讨论

作为良种生产群体，其种子品质好坏直接关系到育苗造林的质量。母树林作为良种生产林分，具有投产快，成本低等优点，但是母树林去劣疏伐仅通过母树表型，并未经过遗传测定，母树间在遗传品质上难免出现优劣混杂[10]。“土贡松”采种母树林种子性状及生活力研究结果为，不同采种母树间在种子表型性状(种子大小、千粒重)上存在显著的差别，同时不同母树间的种子生活力(萌发率)也有很大差异；种子大小、千粒重与种子萌发率、胚根长度无显著的相关性，这与杉木[11]的研究结论类似。考虑到参试母树间的距离相对较近，立地条件较一致，立地环境对不同母树间种子生产造成的影响相对较小，加之母树间的树龄也相同，因此，不同母树间在种子性状及生活力上产生显著差异应主要源于不同母树间的遗传差异；仅根据种子大小、千粒重不足以判断“土贡松”种子的优劣。种子生活力应是一个重要的评价指标。

林木群体的遗传多样性与其遗传基础和异交水平有关，较低的遗传多样性或非随机交配会增加群体近(自)交的概率，引起近(自)交衰退，本研究利用SSR标记分析显示该母树林子代的平均期望杂合度(He及Nei)与大多数种子园及天群体的水平相当[12-14]。说明该母树林遗传基础较宽，满足良种生产群体的基本要求。但需要指出的是，该群体观察杂合度(Ho)显著低于期望杂合度(He)，意味着群体交配不随机，可能存在部分个体近交或自交的情况。同时7个SSR位点中有6个位点固定指数大于零，也证实了群体杂合子不足，存在近交或自交的问题。这也可能是导致该林分部分母树种子萌发率较低的原因之一(参试母树种子萌发率最低仅47%)。

考虑到该母树林树龄已达55a生，母树树体通直高大，枝下高极高，人工辅助授粉极为困难，同时采种成本也极高。建议从该林分乃至整个“土贡松”分布区域内的天然或人工林中挑选遗传品质优良、结实量高的基因型材料，营建“土贡松”优良无性系种子园，实现“土贡松”良种生产的可持续发展。

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Seed Quality and Genetic Diversity of Pinus massoniana Seed Production Stand in Guangxi

NIEYong-xiong1,WEIXun2,ZHANGRong1,ZHANGHai-dong2,ZHOUZi-fu1,BAITian-dao2*

(1.Tianhongling State-owned Forest Farm, Cangwu county, Guangxi543100;2.College of Forestry, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

Seedqualityandgeneticdiversityareimportantfactorsforevaluatingseedproductionpopulation.Inthisstudy,seedphenotypeandviabilityof55aMassonPineseedstandinGuangxiprovincewereinvestigated.Theresultsshowedthatmothertreesforseedcollectionwerehighlysignificantlydifferentbothinseedphenotypictraitsandseedviability(P\%<0.0001).Theformerincludestheseedlength,seedwidth,seedwinglength,seedwingwidth,aspectratioofseeds,aspectratioofseedwingsandgrainweight,andthelatterconsistsofgerminationrateandradicallength.TheseedgerminationratefromdifferentMassonPinemothertreesrangedfrom47%to95%.Theseedphenotypiccharacterspresentednoobviouscorrelationwiththeseedviabilitytraits.ThegeneticdiversityanalysisforMassonPineoffspringtreeswasconductedintheexperiment,andgeneticexpectedheterozygosity(He),andNei’sexpectedheterozygosity(Nei’)were0.602and0.588,respectively,whichindicatedthattheparentstandpossessedawidergeneticbasis.Inaddition,theobservedheterozygosityat0.381andtheexpectedheterozygosityat0.602meansthatnon-randommatingobviouslyoccurredamongindividuals,whichimpliedinbreedingorselfingcouldexisttosomedegree.

MassonPine;seedproductionstand;seedquality;geneticdiversity

2016-08-14 基金项目：广西梧州市科学研究与技术开发计划项目(201501020)；广西大学青年博士科研启动基金项目(XBZ160142)。

聂永雄(1978-)，男，广西苍梧人，工程师，从事林木良种生产与栽培工作。

S791.248;Q

A

*通讯作者