自选乳酸菌发酵核桃乳香气物质研究

薛纯 李艳 李佳 牟德华*

1（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）2（河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

·基础研究·

自选乳酸菌发酵核桃乳香气物质研究

薛纯1*李艳1，2李佳1牟德华1**

1（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）2（河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

核桃属坚果类食物，营养价值极高。核桃仁含有丰富的脂肪、蛋白质、矿物质、不饱和脂肪酸和维生素等营养物质，是天然的保健食品。核桃仁具有预防高血脂、高血压、增强记忆力、延年益寿的功能。乳酸菌是与人类生活密切相关的一类微生物，是人体和动物肠道的优势菌群，具有调节肠道平衡、降低胆固醇、抑制肠道腐败菌生长及减少肠道腐败产物的功能。乳酸菌发酵核桃乳除可保留核桃的营养功能成分外，还可赋予核桃乳特有的乳酸及其他乳酸菌代谢产物，使发酵核桃乳产生清香、醇香和脂香，且乳酸菌发酵产生的多种蛋白水解酶可使蛋白水解为小分子肽和氨基酸，有利于人体的消化吸收。目前国内发酵型核桃乳的研究和产品很少，主要原因是核桃乳内可发酵性糖含量较低，缺少合适的专用菌种，且产品风味存在明显的缺陷。

本研究采用自选乳酸菌对核桃乳进行发酵，利用顶空固相微萃取和气相色谱质谱（HP-SPME/ GC-MS）联用技术分析检测核桃乳发酵和后熟过程中的香气物质变化，全面评估发酵核桃乳的香气成分，为自选乳酸菌的工业化应用和高品质发酵型核桃乳的产品开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃仁，河北养元智汇饮品股份有限公司。

乳酸菌，植物乳杆菌亚种（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利肠球菌（Enterococcus italicus）KDLLJ3-1，由本研究室分别从羊羔美酒大曲和开菲尔粒中分离筛选得到，经过重复序列聚合酶链式反应（repetitive sequence-based polymerase chain reaction，Rep-PCR）技术和16SrDNA序列分析的分子鉴定，并将所得基因序列的测序结果在GenBank数据库进行登陆，经过BLAST相似性比对确定属种，登录号分别为KC454277和KC454280。

氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱-5975质谱，HP-5色谱柱( 30.0 μm×0.25 μmm，0.25 μm)，美国Agilent公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；20 mL顶空萃取瓶，石家庄大晋科技有限公司；手动固相微萃取手柄、磁子及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷的萃取头，美国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵核桃乳的制备

去除核桃仁中的瘪仁、坏仁和杂质等，用0.5%NaOH水溶液浸泡，并煮沸5 min，弃去碱液，用高压水枪冲去核桃仁表面的种皮，再用清水洗涤去除核桃仁表面残留的碱液，直至洗涤水pH值呈中性。按照料液比1∶7（g∶mL）用50℃温水磨浆12 min，将磨好的核桃浆液用纱布过滤，弃去滤渣。滤液用均质机在20 MPa下均质2次，85℃灭菌15 min，自然冷却至室温。接种经活化和驯化后的乳酸菌，接种量为108cfu/mL，植物乳杆菌亚种和意大利肠球菌的比例为2∶1，控温40℃，发酵12 h，降温至4℃后熟21 d，分别检测发酵前和发酵2 h、6 h、12 h以及后熟1 d、7 d、14 d、21 d的香气物质。

1.3.2 核桃乳中香气物质的检测

1.3.2.1 香气物质萃取

采用顶空固相微萃取（HP-SPME）法提取核桃乳中的香气物质。取5 mL试样，加入2 g干燥的氯化钠，放于20 mL顶空萃取瓶中，加磁力搅拌转子，盖密封垫和铝盖，用压杆钳密封，用2 cm-50/ 30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取头针管穿透样品瓶隔垫，调整插入长度，放入50℃搅拌水浴锅中，平衡15 min，推手柄使纤维头伸出针管萃取吸附30 min，取出手柄直接进样，250℃下解吸3 min。

1.3.2.2 香气物质的测定

采用气相色谱质谱（GC-MS）联用检测核桃乳中香气物质。气相色谱条件：载气为氦气（99.999%），流速1.0 mL/min；升温程序为40℃保持12 min，以3℃/min升至108℃保持2 min，再以5℃/min升至250℃保持5 min，进样口温度250℃。质谱条件：离子源温度230℃；四级杆温度150℃；电离方式为EI，电子能量70 ev；扫描质量范围为45 amu～550 amu。

1.3.2.3 香气物质的定性与定量

核桃乳中的香气物质定性采用NIST质谱数据库，并通过检索和查阅相关文献作为参考。香气物质的定量采用总香气物质峰面积归一化法进行各种香气物质相对含量的计算。

1.4 数据分析

每个样品均经过6次测定，结果取平均值，并使用SPSSStatistical 17.0软件对所得数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 核桃乳中香气物质分析

采用HP-SPME/GC-MS联用技术检测发酵前核桃乳，以及发酵和后熟过程中香气物质的含量，结果见下页表1。

由表1可知，核桃乳发酵前，共检测到47种香气物质，占总挥发性物质的56.12%，以醇类和醛类物质为主，特别是正己醇和正己醛相对含量较高，分别占香气物质含量的14.52%和13.92%，这也是导致核桃乳中呈现生味和油脂味的主要原因。Kobayashi等人研究了这些生的油脂味是在打浆过程中核桃中的亚麻酸、亚油酸等在脂氧合酶及氧气的共同作用下催化生成的，主要是醛、醇类物质。刘志强等人在研究去除大豆生味中表示，在加工过程中脂肪氧合酶的活性增强，会形成较多的生油脂味物质，即使加热也不能够去除。

发酵12 h和后熟21 d的核桃乳中，香气物质含量提高了28.56%，香气物质的种类和含量也有很大区别，醇类、酸类和酮类含量明显增加，分别提高110.95%、158.41%和178.47%。发酵前核桃乳中的主体香气物质正己醇在发酵结束时含量最高，达到总香气物质的52.59%，而正己醛含量却明显降低，由13.92%减少到0.35%，可能的原因是在乳酸菌脂肪代谢过程中，正己醛在乙醇脱氢酶的作用下生成己醇。经过乳酸菌的发酵后，醛类物质含量以及种类降低，这与Achouri的研究结果一致，己醛只要存在就会产生令人不愉快的气味，对核桃乳口感影响很大，说明乳酸菌发酵在一定程度可以改善核桃乳的生味和油脂味。

发酵核桃乳在4℃下后熟，物质含量变化最大的是酮类，其中乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）最为显著，其含量由0.10%增长到18.24%，它主要是在发酵后期以及后熟过程中产生的挥发性物质。在乳酸菌的代谢作用下，柠檬酸通过柠檬酸裂解酶分解为乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸进一步转化为二氧化碳和丙酮酸。从丙酮酸到双乙酰可能存在以下2种途径：①丙酮酸与焦磷硫胺素生成活性乙醛，活性乙醛与乙酰辅酶-A缩合后经酶的裂解生成双乙酰；②活性乙醛与其他丙酮酸盐分子缩合，经酶作用形成α-乙酰乳酸，在高氧化-还原条件下，α-乙酰乳酸被氧化形成双乙酰，而在缺氧条件下形成3-羟基丁酮，3-羟基丁酮在氧气充足条件下又进一步氧化为双乙酰。双乙酰是乙偶姻的还原形式，丁酮类、2-庚酮的阈值较低，主要表现出清香、脂香和甜香，很可能是其发酵产生的特征香气成分。发酵核桃乳中正己醇和乙偶姻成为主体香气物质，分别占总香气物质的49.08%和25.28%，使发酵核桃乳具有了芳香和奶油香气。

2.2 核桃乳发酵前后香气的比较

核桃乳在发酵前醇类、醛类的含量相对较高，经过乳酸菌发酵后，香气物质种类发生明显变化，结果见图1。由图1可以看出，醇类、酸类、酮类的含量相对较高，分别为41.81%、8.14%、18.47%，醇类中的正己醇和酮类中的乙偶姻，是乳制品发酵后的特征香气物质。醛类物质含量明显下降，由19.13%降到1.12%，这也是发酵后油脂味减少的主要原因。酯类物质含量也减少，由5.99%降到1.61%，烯类物质在发酵后消失。

图1 核桃乳发酵前后香气物质变化

2.3 数据因子分析

根据因子分析的有关信息，在因子分析前，需要对数据是否适合做因子分析进行可行性检验，利用SPSS软件处理，KMO和Bartlett的检验结果见表2。

表2 KMO和Bartlett的检验

KMO测度的值越高（接近1.0时），表明变量间的共同因子越多，研究数据适合采用因子分析。通过检验得知，KMO值为0.795，大于限定的0.500，表明研究数据适合做因子分析。Bartlett球形度检验的伴随概率值为0.000＜0.010，达到了显著性水平，说明发酵核桃乳香气的变化适合做因子分析。

表1 核桃乳及发酵和后熟过程中香气物质测定结果

表1 核桃乳及发酵和后熟过程中香气物质测定结果（续）

核桃乳发酵前后香气物质因子方差分析结果如下页图2所示。从图2可以看出，发酵前核桃乳中香气成分和发酵2 h的香气成分具有很高的相似性，说明在发酵2 h内，香气物质的变化程度不明显；在发酵6 h后，与未发酵核桃乳相差甚远，香气物质发生了很大的改变；6 h以后的基本的香气都比较接近，尤其是在后熟阶段，香气物质的成分基本不变。核桃乳中的香气风味物质的种类比较少，蛋白质、脂肪以及糖类在发酵过程中的降解或每一类物质的衍生物相互作用产生了新的物质，因此，发酵后核桃乳中的香气物质与发酵前核桃乳中的香气物质有很大的差异性。

图2 发酵核桃乳香气成分因子方差分析

3 结论

本研究采用自选的2株乳酸菌对核桃乳进行发酵，以HS-SPME/GC-MS联用技术检测核桃乳发酵前后香气物质的变化，试验结果表明发酵后香气物质种类虽然减少，但含量增加28.56%；具有水果芳香的正己醇是发酵前核桃乳的主体香气物质之一，发酵后含量明显增加，由25.87%增加到49.08%，而另一主体香气物质发生了重大改变，发酵前具有生乳味的正己醛，被发酵核桃乳中具有油脂香味的乙偶姻取代，两者含量接近，分别为24.8%和25.28%，因此发酵核桃乳具有成熟的水果芳香和奶油酯香。本研究同时证明了自选乳酸菌具有工业应用价值，可以用于高品质发酵型核桃乳产品的开发。

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Study on the aroma com ponents of walnut m ilk by fermentation of lactic acid bacteria

XUE Chun1*LI Yan1，2LI Jia1MOUDehua1**

1（College ofbioscience and bioengineering，Hebei university ofscience and technology，Hebei Shijiazhuang 050018，China）2（Hebei R&D center for fermentation engineering，Hebei Shijiazhuang 050018，China）

采用自选植物乳杆菌亚种KDLLL1-1、意大利肠球菌KDLLJ3-1对核桃乳进行发酵，并在发酵和成熟过程中取样，采用顶空固相微萃取和气相色谱质谱（HP-SPME/GC-MS）联用技术对香气成分进行测定，研究发酵核桃乳在生产和储藏环节香气物质的变化。试验结果表明，发酵核桃乳中香气物质含量提高28.56%，其中醇、酸、酮类物质分别提高110.95%、158.41%、178.47%，而酯类、醛类物质含量下降，烯类物质消失。发酵前的核桃乳中正己醇和正己醛含量最高，分别占总香气物质含量的25.87%和24.8%，而发酵核桃乳中主体香气物质为正己醇和乙偶姻，分别占总香气物质含量的49.08%和25.28%，使产品具有芳香气味和强烈的奶油及油脂香气。研究结果可为自选乳酸菌的应用和发酵核桃乳的开发提供理论参考。

自选乳酸菌；发酵核桃乳；顶空固相微萃取与气相色谱质谱联用；香气物质

Walnut milk fermentation by Lactobacillus plantarum subsp KDLLL1-1、Enterococcus italicus KDLLJ3-1,and in the fermentation and maturation process sampling.The aroma components were determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HP-SPME/GC-MS)to study the changes of aroma substances in the production and storage of fermented walnut milk.The results show:The contents of aroma components in fermented walnut milk increased by 28.56%,alcohols,acids and ketones were increased by 110.95%,158.41%and 178.47%;while the content ofesters and aldehydes decreased,and the alkenes disappeared.The content ofn-hexanol and n-hexylaldehyde in walnut milk before fermentation was the highest,the total aroma content of 49.08%and 25.28%respectively,while the main aroma substances in fermented walnut milk were n-hexanol and acetoin,accounting for 49.08%and 25.28%respectively,so that the product has a fragrant smell and a strong aroma of butter and grease.The results of this study can provide theoretical reference for the application of lactic acid bacteria and the development of fermented walnut milk.

optional lactic acid bacteria；fermented walnut milk；headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry；aroma substances

TS252.54

A

1673-6044（2016）04-0011-06

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.04.005

*薛纯，女，1993年出生，河北科技大学在读本科。

**牟德华，通讯作者，E-mail：dh_mou@163.com.

2016-10-06