沉水植物轮叶黑藻附生细菌对双酚A的降解能力研究

张国森，王 玉，庄晓瑾，杨 劭，蒋金辉（华中师范大学生命科学学院，湖北 武汉 430079）

沉水植物轮叶黑藻附生细菌对双酚A的降解能力研究

张国森，王 玉，庄晓瑾，杨 劭，蒋金辉*（华中师范大学生命科学学院，湖北 武汉 430079）

沉水植物附生细菌可能具有降解转化水体中双酚A（BPA）能力从而影响该污染物在环境中的归趋.以轮叶黑藻为代表，分离筛选其BPA降解附生菌，结果共获得22株，在接种量为1×108个/mL，37℃下72h对BPA的去除率为11.46%～25.06%.选择降解率最高的3株细菌B12、B14和B23，采用16S rDNA鉴定，结合生理生化反应和形态观察，3株细菌分别为属于Lysinibacillus sp.（杆菌属），Brevibacterium sp.（短杆菌属）和Ochrobactrum sp.（苍白杆菌属）.将3株菌株添加至轮叶黑藻无菌苗体系中，发现BPA去除率显著下降（P＜0.05）.物理去除部分野生轮叶黑藻表面部分附生细菌后，BPA去除率反而上升（约5%）.综合本研究结果，沉水植物附生细菌具有降解BPA的能力，但在沉水植物-附生生物体系去除BPA过程中贡献较小（约为23%， 2d），植物本身起关键作用.

附生细菌；BPA去除；沉水植物

双酚A（BPA）是一种环境内分泌干扰物，由于其使用广泛，已成为一种全球性污染物，在世界各地多个水环境中被检测出来［1］.研究表明，即使在环境低浓度下，BPA也可以对水生生物体产生不良影响，如当水体中的BPA浓度在0.228µg/L 时，就会使斑马鱼后代雌性化［2］.而当BPA浓度在1～10mg/L时，对所有水生生物均可以表现出急性毒性［3］.因此，水环境中BPA的去除已经越来越引起人们重视.

沉水植物作为水环境中重要的初级生产者，是健康水生生态系统中重要的组成部分.有研究表明沉水植物具有高效降解转化水体中BPA的能力［4-5］，但其机制不明，其中可能存在附生生物群落的贡献，特别是附生细菌.之前研究表明附生细菌在植物降解有机污染物的过程中具有贡献作用［6-9］，所以推测轮叶黑藻表面可能存在具有降解BPA能力的附生细菌，但目前为止并未见附生细菌降解BPA的相关报道.研究沉水植物附生细菌对水体中BPA的降解转化，将有助于进一步了解沉水植物体系对BPA的高效降解机制，并为揭示该类污染物的环境归趋奠定基础.因此，本文选择常见沉水植物轮叶黑藻（Hydrilla verticillata（L. f.） Royle），对其BPA降解附生细菌进行了分离筛选和鉴定，并通过附生细菌添加和附生生物去除的相关实验探究其在沉水植物体系高效降解BPA过程中的贡献.

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

双酚A标准品购自美国Acros Organics公司，纯度为97%；乙腈及甲醇购自美国TEDⅠA公司，为色谱纯；其他化学药品均为分析纯.高效液相色谱为LC20AT（SHⅠMADZU，日本），扫描电镜为JSM-6700F（JEOL，日本）.

1.2 附生细菌的富集，分离，纯化

LB培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min.

无机盐培养基： K2HPO4·3H2O 6g/L，KH2PO41g/L，NH4Cl 2.5g/L， MgSO4·7H2O 0.41g/L，MnSO4·H2O 0.056g/L， FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl20.022g/L，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min.

附生细菌的富集，分离，纯化：取在无菌自来水培养条件下的轮叶黑藻野生苗的培养水0.1mL，在无菌条件下涂布于含BPA（浓度为10mg/L）的LB固体培养基上，37℃下富集培养24h后，选择不同菌落，多次划线分离后挑取单菌落，再将所得单菌落接种到以BPA（浓度为10mg/L）为唯一碳源的无机盐固体培养基上，于37℃下培养24h后，反复划线分离纯化几次得到单菌株.

1.3 附生细菌降解能力的测定

将筛选出来的单菌株接种到LB液体培养基中，37℃培养24h后，10000g离心10min，弃上清，用无菌生理盐水将菌体洗3次后，接种到BPA为唯一碳源的无机盐液体培养基中，BPA浓度为10mg/L，接种量为1×108个/mL，每组3个重复，均在37℃下振荡培养72h后，检测剩余BPA的浓度，并计算降解率：DR=（C0-Ct）/C0× 100%，其中DR为降解率，C0为初始BPA浓度，Ct为最终BPA浓度.

1.4 16S rDNA的扩增和序列测定及系统发育树的构建

收集菌体，提取DNA作为扩增模板，扩增引物序列：上游27f：AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG，下游1492r：TACGGCTACCT，酶为康为世纪EsTaq MasterMix，PCR反应条件： 94℃ 5min，94℃30s，55℃ 30s， 72℃ 1min，循环30次，72℃延伸5min.产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测.测序工作由上海生工生物公司完成.获得的序列在NCBⅠ进行Blast相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX 1.8进行序列匹配分析，通过MEGA 5.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建发育树.

1.5 附生降解菌添加到轮叶黑藻无菌苗

轮叶黑藻无菌苗的培养参照文献［10］.取约2cm轮叶黑藻的健壮芽尖，经70 % 的乙醇浸泡3 0s及 10 % 的次氯酸钠表面消毒10min后，用无菌水反复冲洗5遍，放入MS（3%蔗糖）静置培养，取长出的无菌芽段用于实验.按照上述处理（1.3）将不同组合细菌（包括单一组B12、B14、B23和混合组B12+B14、B12+B23、B14+B23、B12+ B14+B23，共7个处理组）接种到含有10mg/LBPA的无菌水中，并按照10g/L的比例添加轮叶黑藻无菌苗，分别记作轮叶黑藻+BPA+B12、轮叶黑藻+BPA+B14、轮叶黑藻+BPA+B23、轮叶黑藻+BPA+B12+B14、轮叶黑藻+BPA+B12+B23、轮叶黑藻+BPA+B14+B23、轮叶黑藻+BPA+B12+ B14+B23；同时设植物组（记作轮叶黑藻+BPA）、空白对照组（记作BPA）作为对照，每个处理设置3个重复.降解体系250mL，温度（25±1）℃，光照4000lux.每0，24h， 48h，72h，96h取样测定水中BPA的浓度.

1.6 物理去除部分附生细菌

将采来的新鲜轮叶黑藻野生苗分为两组，一组直接放入含有BPA的无菌水中进行降解，记作未去附组；另一组参照文献［11］的处理方法，经超声，涡旋处理后将植物放入含有BPA的无菌水中进行降解，记作去附组；而将获得的附生细菌离心（5000g，10min）收集后加入含有BPA的无菌水中进行降解，记住附生组.降解体系和条件同1.5，每个处理均设置3个重复.处理2d后检测水体中双酚A的含量.

1.7 双酚A的定量检测

采用高效液相色谱法（HPLC）对双酚A进行检测，样品经12000r/min离心10min，取上清过0.22µmol/L尼龙膜后，用HPLC检测.高效液相色谱仪为岛津LC20AT，色谱柱为Agilent C18反相柱，色谱条件：乙腈：超纯水=65：35（V/V），流速为1.0mL/min，紫外光检测波长278nm，进样量20µL.

1.8 数据的统计分析

数据分析采用一元方差分析，多重检验采用Duncan法，数据的正态分布采用Kruskal-Wallis H方法检验，方差齐性采用Levene方法检验，显著水平为0.05.

2 结果

2.1 附生细菌的筛选及降解效率测定

经过富集纯化后，在以BPA为唯一碳源的无机盐培养基上共筛选出22株具有降解BPA能力的细菌，分别命名为B1～B22.降解菌的整体降解效率较低，在30%以下，其中10%以下10株，10%～20% 10株，20%以上2株.表1列出了降解率超过10%的细菌，共12株.由表1可以看出，B23和B14的降解效果最好，72h的降解率超过了25%，其次为B12.选取效果最好的3株细菌B12，B14和B23进行下一步鉴定.

表1 附生细菌的BPA降解率Table 1 Degradation of BPA by the isolated epiphytic bacteria strains （mean ± SE， n=3）

2.2 附生细菌的鉴定

表2 菌株B12， B14和B23的形态特征Table 2 Colony morphological characteristics of strain B12， B14and B16

图1 菌株B12， B14， B23的扫描电镜照片（×10000）Fig.1 Scan electron micrographs of strain B12， B14and B23（×10000）

表3 菌株B12，B14和B23 16S rDNA 序列对比结果Table 3 Comparison of 16S rDNA sequences of strain B12， B14 and B23

选取降解效果最好的3株细菌B12、B14、B23进行形态观察（表2）和扫描电镜观察（图1）.3种细菌在扫描电镜下的形态均为杆状，革兰氏染色为阳性.3株细菌经菌落PCR测序后，在GenBank上登录进行Blast对比，结果如表3所示 ，3株 细 菌 分 别 与Lysinibacillus sp.，Brevibacterium sp.， Ochrobactrum sp. 的相似度达到99%，结合细菌的形态特征，3株细菌分别命名为Lysinibacillus sp.B12，Brevibacterium sp.B14和Ochrobactrum sp.B23.图2为3种细菌的系统发育地位.

图2 B12，B14和B23的16S rDNA基因系统发育地位Fig. 2 Phylogenetic tree of strain B12， B14 and B23 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 附生细菌对轮叶黑藻无菌苗去除BPA的影响

图3分别表示轮叶黑藻无菌苗及添加不同组合（单一组和混合组）附生降解菌B12，B14和B23对BPA的去除效率（a）及各组细菌的生长情况（b）.可以看出轮叶黑藻无菌苗对BPA具有较高的去除效率，24h达到90.3%±1.08%，96h达到99.79%±1.08%.而添加不同组合附生降解菌B12，B14和B23到无菌苗系统后，显著的影响了轮叶黑藻对BPA的去除（P＜0.05）.在24h时，对照组与处理组之间差距达到最大，而随着时间的推移，二者之间的差距逐渐缩小，到96h时，二者差距最小，但单一组仍有显著低于对照组（P＜0.05）.而添加不同细菌组合的处理组去除率之间也存在差异， 混合组的去除率均显著高于单一组（P＜0.05）.在单一组中，24h时轮叶黑藻+BPA+B23的BPA去除率显著高于轮叶黑藻+BPA+B12和轮叶黑藻+BPA+B14（P＜0.05），到72h后，3个处理组的BPA去除效率差异消失（P＞0.05）.而混合组中，在24h时， BPA+轮叶黑藻+B12+B23的去除率最高，显著高于其他3组（P＜0.05），48h后4个处理组的BPA去除率之间没有显著差异（P＞0.05），去除率均在90%以上.

图3 轮叶黑藻无菌苗及添加不同组合附生细菌对BPA的去除率及细菌生长情况Fig.3 BPA removal rates of the combinations of aseptic Hydrilla verticillata and the addition of epiphytic bacteria and growth （OD600） of epiphytic bacteria （The data are presented as mean ± SE of three individual experiments）

不同组合细菌添加到无菌苗体系中后，总体细菌数量均在增大（图3b），但细菌的生长速度不同.单一组中B23适应期较短，24h生长速度明显高于其他2株细菌（P＜0.05），72h后B23的生长速度均趋于平稳，其他2株细菌仍有较快的生长速度.不同细菌混合后，24h时细菌的总体生长速度高于单一细菌，而72h后混合组细菌总量均出现下降趋势.各组细菌的生长速度与上述处理组去除率之间的关系一致.

图4是对照组和轮叶黑藻+BPA+B23在96h收获后的扫描电镜图片，可以看出96h后对照组轮叶黑藻无菌苗表面并没有细菌出现，而轮叶黑藻+BPA+B23中细菌已经附着到轮叶黑藻无菌苗表面.

图4 无附生菌添加与添加附生菌B23 96h后轮叶黑藻无菌苗的扫描电镜照片（×5000）Fig.4 Scan electron micrographs of aseptic seedlings of Hydrilla veticillata with or without the epiphytic bacteria B23 addition （×5000， 96h treatment）

2.4 物理去除部分附生细菌对轮叶黑藻去除BPA的影响

图5 附生细菌去除前后轮叶黑藻对BPA的去除率及收集的附生细菌对BPA的去除率（2d）Fig.5 BPA removal rates of Hydrilla verticillata （with or without epiphytic bacteria） and epiphytic bacteria （2-day treatment， mean ± SE）

物理处理（超声+涡旋）被认为是最佳的去除沉水植物附生细菌的手段.图5为物理去除前后轮叶黑藻对BPA的去除率.由图5可以看出，物理去除部分附生生物后，植物对BPA的去除能力增加，2d后去附组对BPA的去除率高于未去附组（约5%），但二者并没有显著差异（P＞0.05）.同时，附生组对BPA去除率较低，2d的去除率仅为8.5%±2.11%，约占沉水植物-附生生物体系BPA总去除率的23%

3 讨论

本研究通过直接筛选（表1）和物理去除（图5）的方式证明沉水植物的附生细菌具有降解BPA的能力，降解效率在（11.46±2.38）%～（25.06± 1.63）%的范围内，与筛选的高效降解菌［12-13］相比效果较弱.原因可能是细菌中降解BPA的关键酶是诱导酶，其活性与环境中的BPA浓度相关［14］.高效降解菌通常筛自高污染的活性污泥或水体，高浓度的污染物会诱导细菌降解酶的表达或高效降解菌的富集，而采集轮叶黑藻的水体中BPA的浓度较低，并不利于该类污染物高效降解菌群体的发展，所以附生细菌的降解效率普遍较低，这与Kang等［15］发现的自然水体中BPA降解细菌普遍存在但降解效率低的结果类似.另外当附生细菌与植物共存时，植物会分泌如糖类，脂肪酸等供细菌利用［16］，这些物质会比BPA等污染物更容易被细菌作为碳源利用，减少了污染物对细菌的诱导，进一步降低了其对污染物的降解能力［17］.郑师章等［18］在研究凤眼莲的附生细菌降解酚时也得出类似结果.很多研究表明［19-20］附生细菌与植物一同降解有机污染物可能是一个普遍存在的现象，但关于植物与附生细菌在降解污染物过程中各自所占比例研究较少.多数研究证明将获得的降解菌添加到植物表面后会影响植物的降解效率，有些降解效率提高，有些则会降低，这可能与降解环境有关，包括植物物种、微生物物种及污染物种类［18,21-22］.Toyama等［20］在研究Spirodela及根际细菌对污染物降解效果时发现，植物与细菌在降解体系中的贡献与污染物的种类有关，在降解苯酚时主要是根际细菌起主导作用，而在降解二氯苯酚时是植物起主导作用.在本研究中，沉水植物在整个BPA去除体系中起主要作用.

目前关于BPA的降解菌有很多报道，来源也较广泛［23］，主要有筛自天然水体如Streptomyces sp.［24］，沉 积 物 如Bordetella sp.strainOS17，Pseudomonas sp.LBC1［25-26］，垃圾渗滤液 如Achromobacter xylosoxidans strain B-16［27］，活性污泥如Citrobacter sp. 57， Serratia marcescens NB1［28-29］等.而本研究中降解效率较高的3种细菌分别属于Lysinibacillus sp.，Brevibacterium sp.和 Ochrobactrum sp..目前关于3个属的报道主要有Lysinibacillus sp.对农药马拉硫磷［30］，奥美拉唑［31］，偶氮染料［32］等的降解，Brevibacterium sp.的研究有对邻苯二甲酸二乙酯［33］，二苯并呋喃［34］和除草剂［35］等的降解，Ochrobactrum sp.对雌二醇［36］，多环芳烃［37］和对硝基苯酚［38］的等降解，对于BPA的降解还未见报道.

影响细菌对BPA的因素很多，包括投菌量、温度、pH值、BPA初始浓度等［39-40］.本研究中降解菌的效率偏低，也可能与其降解条件有关.不同细菌对BPA的最优降解条件有很大区别，如袁理等［41］筛选的BPA降解菌的最佳降解条件为接种量为0.6%，初始pH值为7.0，温度为30，℃初始浓度为10mg/L时达到最大值46.93%，而房芳等［42］报道的降解菌在接种量为5%，pH=4，BPA浓度为50.18mg/L，8d后降解率可达到71.79%.蒋俊等［28］与邓伟光等［29］均从活性污泥中筛选出的BPA降解菌，其BPA最佳降解条件相似（接种量2%～5%， pH7～8，温度30～32℃，BPA 10mg/L）.

本研究中，附生细菌添加到无菌苗降解体系后会使无菌苗体系降解效率显著减少（P＜0.05），但随着时间增加与对照组差距逐渐减小（图3a）.原因可能是相对浓度较大的细菌进入无菌苗体系后，附着在植物表面，影响了植物对BPA的去除，而同时细菌因环境的变化进入迟缓期，也影响了细菌的降解能力，随着培养时间的增加细菌适应环境，降解能力显著增加，缩小了与无菌苗体系的去除率差异.Saiyood等［43］研究时也发现类似的结果，部分降解菌添加到无菌植物根系后会减少植物对BPA降解.细菌与植物之间还存在相互促进作用，共同降解污染物，这与细菌和植物的种类有关［19,23］.不同细菌组合后BPA的降解效果高于单一细菌，说明细菌间具有相互促进的作用，这与李明堂等［44］的研究结果一致.不同细菌组合后形成的菌群对BPA降解率显著上升原因可能是混合菌群加速了中间代谢物的转化利用从而提高了污染物的降解速度.而不同细菌间的进化距离也会影响细菌间对污染物降解的协同作用，亲缘性近，进化距离小的细菌间协同性更强［45］，本研究中B12与B23的进化距离较近，而与B14的进化距离较远，这也可能是造成B12+B23组合后降解效果高于其他3个组合的原因.而混合组细菌在72h后数量出现下降趋势，可能是因为体系中95%以上的BPA都被去除，没有足够BPA的诱导导致细菌生长减缓，数量下降.

物理去除部分附生细菌后，植物去除BPA的效率升高，说明附生细菌在沉水植物体系中可能起到隔离作用，减少植物与BPA的直接接触，这可能是保护植物的一种方式.有研究表明［46-48］附生细菌能够在植物根系形成细菌膜帮助植物抵抗不良环境并促进植物的生长.邓欢欢等［21］在研究黄麻对蒽的降解时发现在蒽浓度为300mg/kg条件下，加菌组植物在42d后生物量是不加菌组的11倍.水中的细菌还能够平衡水体中的过高的氮磷及其他污染物，减少其对沉水植物的毒害［49］.但因为附生细菌对水体中BPA降解能力有限，并不能补偿因隔离植物作用减少的BPA去除，最终减少了沉水植物及其附生生物体系对BPA的去除.

4 结论

4.1 轮叶黑藻附生细菌中共筛出22株能够利用BPA的细菌，其中降解效率在10%以上的12株，降解率在（11.46±2.38）%～（25.06±1.63）%之间.

4.2 通过对降解率最高的3株细菌B12，B14和B23进行形态观察，生理生化鉴定和16r DNA比对，认为它们分别属于Lysinibacillus sp.（杆菌属），Brevibacterium sp.（短杆菌属）和 Ochrobactrum sp.（苍白杆菌属）.

4.3 轮叶黑藻附生细菌具有降解水体中BPA的能力，2d的降解率为8.5%±2.11%，约占整个沉水植物-附生生物体系总去除率的23%.

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Degradation of bisphenol A by the epiphytic bacteria of submerged macrophytes Hydrilla verticillata （L. f.） Royle.

ZHANG Guo-sen， WANG Yu， ZHUANG Xiao-jin， YANG Shao， JIANG Jin-hui*（School of Life Sciences， Central China Normal University， Wuhan 430079， China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：3081～3088

Epiphytic bacteria of submerged macrophytes may have the capability in biodegradation and/or biotransformation of bisphenol A （BPA） in water column， therefore affect the fate of such environmental pollutant. In this research， Hydrilla verticillata （L. f.） Royle was selected and their attached BPA degrading epiphytic bacteria attached were isolated. Among the 22bacteria strains， the BPA removal rates were from 11.46% to 25.06% with the inoculum density at 1×10-8cell/mL and culture at 37℃ for 72h. The most effective bacteria strains， B12， B14and B23 were identified as Lysinibacillus sp.， Brevibacterium sp. and Ochrobactrum sp.， respectively， according to the results of 16S rDNA sequencing and morphological， physiological and biochemical tests. But aseptic seedlings of H. verticillata significantly decreased their BPA removal rates after the addition with B12， B14and B23 （P＜0.05）. Natural seedlings of such species surprisingly increased about 5% in BPA removal after partially removing their epiphyte with physical methods. All the results indicated that epiphytic bacteria of submerged plant can remove BPA， although their contributions（about 23%） are less than the host plants in the submerged macrophytes-epiphyte associations.

epiphytic bacteria；BPA removal；submerged macrophytes

X171.5，X172

A

1000-6923（2016）10-3081-08

张国森（1989-），男，河南平顶山人，博士研究生，主要从事污染生态学研究.

2016-01-30

国家水体污染控制与治理科技重大专项（2013ZX07104-004-03）；国家自然科学基金（31200399）

* 责任作者， 讲师， jiang_jhcn@126.com