多糖酶法改性研究进展

王 迪 代 蕾 高彦祥

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

多糖酶法改性研究进展

王 迪 代 蕾 高彦祥

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

多糖是一种在自然界分布极广的天然生物大分子，具有生物相容性、可接受性和可降解性，被广泛应用于食品、药品、化妆品以及化工行业产品中。然而，由于某些多糖水溶性差或天然多糖不具备一些功能特性，其应用受到了限制。利用物理、化学或酶改性方法对多糖结构进行修饰，改善了其功能特性，扩大了其应用范围。酶具有高效性、特异性和选择性，酶法改性多糖安全性高、条件温和且环境友好，是一种极具潜力的多糖改性方法。酶法对多糖进行改性主要包括对多糖的水解和共价接枝。主要以多酚氧化酶、过氧化物酶、转谷氨酰胺酶和脂肪氧化酶等为例，介绍了近年来多糖酶法改性的研究进展，主要综述了酶法改性酶的种类、多糖改性方法和反应类型，讨论了改性多糖的功能特性，并对其应用前景进行展望。

多糖 酶法改性 功能特性

多糖(Polysaccharide)是由多个单糖分子缩合、失水而成的高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖在自然界广泛分布于动植物和微生物中，其种类众多。多糖作为一种可再生资源，具有成本低廉、生物可降解、无毒环保、功能丰富等优点。在生物学意义上，多糖一般作为结构物质或储能物质。少数多糖具有抗氧化、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖以及免疫调节活性。多糖的理化性质和功能特性是由其结构决定的，大多数天然多糖需要经过结构修饰才能表现出理想的生理活性。

多糖还具有许多反应活性位点，如乙酰氨基、氨基、羧基和一些活性羟基,可以通过多种化学反应对其进行修饰。此外，多羟基结构使其具有亲水性[1]。近年来，主要通过物理、化学和酶催化方法对多糖进行改性。物理改性方式主要有超声、射线辐照、高速剪切、动态高压微射流等，物理改性主要针对多糖的分子量或流变学特性进行修饰，一般不涉及化学结构的改变。化学改性主要包括的反应方式有氧化、硫化、酯化、酰胺化，利用化学反应能得到高产率多糖衍生物，但这种改性方式需要添加化学试剂，且反应不具有选择性，反应进程也难以控制。比较而言，酶催化改性安全无毒、条件温和、环境友好，操作简单，酶催化改性多糖反应更便于控制[2-3]。

随着酶制剂产业和生物工程技术的发展，酶的种类越来越多，其品质也明显提高，酶催化改性多糖的研究也更加深入。酶法改性主要包括对多糖进行水解和共价接枝。从酶的种类来看，主要有壳聚糖酶、溶菌酶、纤维素酶和脂肪酶等专一性和非专一性水解酶，还有转谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等催化多糖共价接枝的酶；从多糖分子水平上看，主要包括多糖分子中糖苷键的断裂和重排、分子内或分子间交联或对多糖分子侧链基团进行修饰。

1 多糖酶法水解

多糖可以通过化学、物理或生物的方法进行水解，产生一系列中间产物，包括单糖和低聚糖等。化学法水解多糖一般通过加入化学试剂使多糖分子中糖苷键发生断裂或重排，主要包括酸法、氧化法和亚硝酸盐法[4-6]。化学法水解多糖操作简单、反应迅速，水解效率较高，但化学试剂的引入带来严重污染，且产物分子量分布较宽，不易控制。物理方法主要包括利用超声波、辐射和微波辅助法对对多糖的糖苷键进行断裂。物理法水解多糖在不引入化学试剂的情况下对多糖进行水解，操作简单且污染小，但水解效率低，成本高。生物降解法主要是酶法水解，酶法水解多糖具有特异性，产物均一性高，反应高效、温和、可控，是一种理想的多糖降解方法。

酶法水解多糖的酶主要分为专一性水解酶(壳聚糖酶、纤维素酶等)和非专一性水解酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)。壳聚糖酶主要存在于细菌、真菌和某些植物当中。壳聚糖酶专一性催化壳聚糖的β-1，4-糖苷键断裂，生成壳寡糖[7]。纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称[8]。Moraïs等[9]利用纤维酶和木聚糖酶水解纤维素，评价了纤维素酶和木聚糖酶水解纤维素的协同作用。Wu等[10]利用α-淀粉酶对壳聚糖进行水解，优化了酶催化反应条件，得到低分子量的水溶性壳聚糖。Muzzarelli等[11]利用小麦胚芽脂肪酶水解壳聚糖，发现水解速率与酶的浓度呈对数关系，水解产物分子量降至13 ku，与原壳聚糖相比，产物黏度下降。

近年来，人们对酶水解多糖进行了广泛研究，但主要局限在实验室研究，实现大规模工业化生产还存在一定的困难。另外，研究主要集中在酶法水解多糖的影响因素上，而对其水解机理研究较少。要实现大规模工业化生产，一方面对反应过程进行优化，提高反应效率；还要对降解机理进行详细的研究，为控制和优化反应条件从而实现工业生产提供参考。

2 多糖酶法共价接枝

利用酶法通过共价接枝对多糖进行改性，常用酶的种类包括氧化还原酶、转谷氨酰胺酶等。氧化还原酶主要催化氧化还原反应，催化底物的氧化或还原时需要电子供体或受体，这类反应主要机理是电子的转移。催化这类反应的氧化还原酶主要包括多酚氧化酶、过氧化酶和脂肪氧化酶等。转谷氨酰胺酶催化酰胺基转移反应。根据不同类型的酶对多糖共价接枝改性方法、反应类型及机理进行介绍，并讨论多糖衍生物的特性及其应用。

2.1 多酚氧化酶

多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，主要包括漆酶(对苯二酚氧化酶)、单酚氧化酶(酪氨酸酶)和双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶，Catechol oxidase, EC.1.10.3.2)。这类酶在氧存在条件下酚类氧化成邻苯醌或对苯醌，在多糖共价交联中，主要应用漆酶和酪氨酸酶催化其共价修饰反应。

2.1.1 漆酶

漆酶(Laccase, EC.1.10.3.1)是单电子氧化还原酶，其作用机理主要是在底物自由基的形成及与漆酶中的铜离子协同作用。漆酶可氧化多种单酚、邻位或对位酚、甲氧基酚、芳香族胺或脂肪族胺等底物。漆酶对多糖进行改性修饰，可以改善其物理化学性质，提高其生物功能特性。壳聚糖大分子中有活泼的羟基和氨基，在均相与非均相条件下均可以利用多种酶催化其改。研究证明壳聚糖-阿魏酸/阿魏酸衍生物水溶性较好，抗氧化活性、抗菌性提高，其流变学特性也有所改变；利用该反应产物制备抗氧化性壳聚糖膜或直接诱导交联形成壳聚糖凝胶[12-15]。此外，没食子酸、咖啡酸、儿茶素、二羟基苯甲酸等也通过漆酶的催化接枝到壳聚糖上，没食子酸或咖啡酸的壳聚糖衍生物具有抗菌抗氧化活性，儿茶素或二羟基苯甲酸的衍生物具有螯合金属离子能力[16-17]。研究发现，将漆酶作为催化剂诱导阿魏酸和甜菜果胶可以形成凝胶，阿魏酰基被漆酶氧化后形成醌，进行亲核加成形成交联的共价键，该共价反应提高了果胶的黏度和乳化性[18-19]。近年来，多有研究利用酶诱导生物大分子接枝共聚，形成具有多层结构的乳液或凝胶稳定的纳米颗粒，再将这类传递系统用于功能因子的包埋与传递中。

蛋白质与多糖的接枝反应多通过美拉德反应进行，但该反应具体机理尚未完全解释清楚，且副产物多，研究发现反应可能带来一定的安全性问题[20]。酶法催化蛋白质和多糖发生氧化还原反应，利用多酚氧化酶将蛋白质酪氨酸残基氧化为醌，醌再与壳聚糖进行非酶反应。通过氧化明胶中蛋白质酪氨酸残基形成醌，再与壳聚糖交联，该反应主要用于制备生物活性水凝胶。研究发现通过漆酶诱导的壳聚糖-明胶水凝胶具有一定的抗菌性和抵抗细胞壁溶解酶的能力[21]。另有较为新颖的技术是利用壳聚糖对漆酶进行包埋制备成纳米颗粒，这种漆酶纳米胶囊具有抗菌能力，且在天然环境下半衰期长[22]。利用酶诱导接枝蛋白质和果胶主要提高其水溶性和热稳定性。Jung等[23-24]利用漆酶诱导β-乳球蛋白和甜菜果胶制备共价接枝产物，通过加热β-乳球蛋白将酪氨酸基团暴露并与甜菜果胶的阿魏酰基氧化交联得到更高的共价接枝产物得率，研究发现产物有良好的乳化稳定性，且蛋白质的等电点发生改变，改善其在原等电点附近的水溶性。Soltani等[25]制备了包埋鱼油的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，将该纳米颗粒注入到甜菜果胶溶液中，再利用漆酶诱导果胶形成凝胶，体系流体类型从牛顿流体变为幂律流体，形成了稳定的鱼油传递体系。

天然纤维素不溶于水、柔顺性差且分子体积较大，限制了其应用。Patel等[26]利用漆酶催化四甲基呱啶氮氧化物和纤维素，向纤维素中引入羧基或醛基，将其氧化，主要是利用漆酶将四甲基呱啶氮氧化物诱导形成自由基，发生氧化后作为介质将纤维素伯羟基和所在的亚甲基氧化为羧基或醛基，研究发现氧化后的纤维素应用在造纸中，表现出更好的持水性和抗拉强度。为了提高纤维素的抗氧化活性、抗菌活性或持水性，有研究将咖啡酸、异丁子香酚、没食子酸十二烷醇酯通过漆酶诱导氧化形成醌后与纤维素伯羟基反应，形成多酚-木质纤维素共价复合物[27-28]。另有研究利用漆酶将丁香醛、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等小分子多酚接枝到纤维素上，由于多酚的接枝，改性纤维素抗菌能力明显提高[29]。

2.1.2 酪氨酸酶

酪氨酸酶(Tyrosinase, EC.1.14.18.1)将单酚或双酚结构氧化为醌，醌与多糖的氨基、其他酚羟基、氨基酸或多聚物发生迈克尔加成或席夫碱加成。但利用酪氨酸酶催化该反应可能导致一些多酚二聚体或其他低聚物等副反应物的生成[30]。

研究表明在均相体系中，可以通过蘑菇酪氨酸酶诱导壳聚糖与熊果苷或咖啡酸形成凝胶，凝胶强度与多酚浓度有关[31-32]。另有报道在均相反应中合成壳聚糖-多酚共价复合物，该壳聚糖衍生物流变学特性发生变化或抗氧化活性提高，其溶解性也明显改善，可溶于酸性或碱性溶液中[33-34]。在非均相体系中，蘑菇酪氨酸酶将对己氧基苯酚氧化为醌，醌与壳聚糖氨基反应，形成共价键，从而对己氧基苯酚对己氧基苯酚在非均相条件下被接枝到壳聚糖膜上，形成疏水性膜表面；蘑菇酪氨酸酶也可以作用于咖啡酸的酚羟基，将咖啡酸氧化为醌，接枝到壳聚糖膜表面，调节膜的机械强度，增加了其弹性，并赋予其抗氧化活性[32-33]。Vartiainen等[35]利用里氏木霉真菌酪氨酸酶催化疏水性多酚(没食子酸辛酯或没食子酸十二烷醇酯)接枝到壳聚糖上，该壳聚糖衍生物可用于抗菌性食品包装材料。

酪氨酸酶催化壳聚糖和蛋白质共价结合，可以增强其理化性质和生物活性。应用较多的是催化形成丝素蛋白与壳聚糖共价产物，研究表明，该共价产物主要通过迈克尔加成和席夫碱加成机理生成，红外光谱表明了壳聚糖氨基的变化，另外丝素蛋白的酪氨酸残基被氧化。酪氨酸酶催化丝素蛋白酪氨酸残基氧化为醌，醌与壳聚糖氨基发生非酶作用生成共价键[36]。Sampaio等[37]研究了反应pH对共价产物得率的影响，发现在pH 7.0得率最高，而该溶液中壳聚糖几乎不溶，说明酶活性对反应得率的影响大于壳聚糖的溶解度。通过催化壳聚糖与丝素蛋白共价，丝素蛋白的热稳定性有所提高，另外吸水性、抗皱性、抗菌性以及着色性有所改善[38]。

2.2 过氧化物酶

过氧化物酶(Peroxidase, POD)是由单一肽链与一个铁卟辅基结构形成的血红蛋白酶，是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的氧化还原酶，可催化过氧化氢、氧化酚类、胺类化合物、杂环化合物和一些无机离子。辣根过氧化酶(Horseradish, HRP)是一种重要的过氧化物酶，在过氧化氢存在时催化底物发生氧化还原反应。

多项研究辣根过氧化物酶诱导壳聚糖与没食子酸或没食子酸酯发生共价交联，表明共价产物具有抗氧化活性、抗菌活性且产物水溶性得到改善[39-41]。另有研究将辣根过氧化酶应用到双层乳液的构建中，利用辣根过氧化酶诱导乳清分离蛋白和甜菜果胶在油滴外形成牢固的双层，相比于以往仅利用静电吸附构建的双层乳液，该乳液稳定性更强[42]。由于淀粉具有冷水不溶性，高浓度时黏度高、流动性差，在酸、热、剪切等外力作用下不稳定等缺陷，使其应用受到极大的限制，因此，对淀粉进行改性具有重要意义。有研究利用辣根过氧化酶和过氧化氢诱导丙烯酰胺接枝到淀粉上，发现在酶的诱导下乙酰丙酮被氧化生成自由基，然后从淀粉的羰基上夺取质子，形成羰基自由基，自由基作为引发剂发生一系列共聚反应；结果表明形成的共聚产物具有良好的吸水性，可以用于造纸或纺织工业[43-44]。Shogren等[45]利用漆酶诱导木质素磺酸钠和玉米淀粉接枝共聚，产物具有良好的抗氧化活性，且淀粉硫酸酯中的硫酸基团增加了聚合物阳离子结合的能力。

2.3 脂肪氧化酶

脂肪氧化酶(Lipoxidase, LOX)由单一的多肽链组成，是一种含非血红素铁、不含硫的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化衍生物。利用脂肪氧化酶催化壳聚糖共聚反应，酶具有一定的区域选择性和对映选择性，可以用于化学-酶诱导共聚反应中[46]。

2.4 转谷氨酰胺酶

转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，简称TGase或TG)针对蛋白质的酰胺基，催化亲核反应，从而引发蛋白质或多肽之间的共价交联，催化反应时主要利用蛋白质谷氨酰胺残基上的-甲酰胺基作供体，可利用分子内或其他分子肽链中的赖氨酸残基中的ɛ-氨基作为受体，也可利用伯氨基或者水作为受体进行共价交联反应[47]。

Jiang等[48]利用乳清蛋白和壳聚糖制备可食膜，通过转谷氨酰胺酶诱导后可食膜隔离水和抵抗机械压力的能力都有所提升。Porta等[49]针对转谷氨酰胺酶诱导壳聚糖形成可食膜进行了综述。另有研究利用转谷氨酰胺酶诱导蛋白质和壳聚糖形成凝胶。通过对转谷氨酰胺酶和酪氨酸酶诱导明胶与壳聚糖形成凝胶进行对比发现，转谷氨酰胺酶诱导的凝胶强度比酪氨酸酶诱导的凝胶强度强，这可能是由于前者通过N-ɛ-(-谷氨酰)赖氨酸交联而成，而后者是通过蛋白质酪氨酸氧化成醌后攻击壳聚糖共价而成，二者的连接方式完全不同[50-52]。Villalonga等[53]利用转谷氨酰胺酶合成了牛胰蛋白酶与环糊精的共价接枝产物，研究发现接枝后的胰蛋白酶活性提高，且其在碱性条件和热环境下的抵抗能力增强。

2.5 其他

多糖可以作为利用酶法诱导共聚反应的引发物，通过接枝共聚可以控制其亲水亲油平衡值。在微波辐射下利用猪胰脂肪酶催化L-乳酸和壳聚糖得到高接枝率的共聚产物，该产物与壳聚糖相比，虽然热稳定性和结晶性有所下降，但却是一种良好的细胞吸附和增殖基质物质，可以作为生物支架材料使用[54]。另有研究利用脂肪酶将脂肪酸和高甲氧基果胶合成脂肪酸酯两性化合物，经过长链脂肪酸的修饰，扩展了果胶的应用范围；另外该研究表明脂肪酶可以特定的将脂肪酸接枝到果胶的6—OH上，具有选择性[55]。Gremos等[56-57]研究了酶催化丙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯与纤维素发生酰化反应，先利用离子液体或超临界二氧化碳对纤维素进行预处理，使多糖结构舒展，再采用四种固定化脂肪酶催化该酰化反应，合成多种纤维素酯，纤维素酯的酰化程度决定了其吸湿性。在另一项研究中，利用脂肪酶催化硬脂酸与羟丙基纤维素进行发生酯化反应，研究发现通过减压除去副产物可以在一定程度上提高反应产率[58]。另外有研究利用磷酸化酶合成直链淀粉-壳聚糖共聚物、麦芽糖-壳聚糖共聚物，利用酶催化法得到的新型高分子聚合物得率较高[59-60]。

3 结论与展望

酶法改性多糖改善了天然多糖的理化性质、功能特性和生物活性，例如将抗氧化性多酚接枝到多糖上，赋予其抗氧化、抗菌、抗癌等优良的生物活性；也可以氨基酸或蛋白接枝到多糖上，将2种高分子的优良功能特性进行整合；或对多糖进行疏水性修饰，制备两亲型分子，应用到药物或功能活性成分的传递系统中；通过聚合反应可以制备新型功能材料，应用于医药、日化等行业。然而，酶改性多糖主要集中在对多糖理化或功能特性上的研究，而多糖作为一种结构或储能物质，其营养价值也需要考虑，很少从多糖营养价值的改善层面进行研究。另外，诸多酶改性研究中只有一部分能转向实际应用，为了能使科研成果转化为生产力，还需要加强科学研究与生产实践的结合，促进酶改性多糖产业的发展。

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Research Progress on Enzymatic Modification of Polysaccharides

Wang Di Dai Lei Gao Yanxiang
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083)

Polysaccharides were biocompatible, adaptable and biodegradable natural biopolymers which can be found in almost all living organisms. They were used extensively in various industries, such as food, pharmaceuticals, cosmetics and chemical products. However, their practical application was limited, as certain polysaccharides had poor water solubility and need to be endowed with novel functions. Physical, chemical or enzymatic modification of their structure appears as an available method, to improve their functional properties, and thus to expanded the field of applications. Enzymes were provided with high efficiency, specificity and selectivity properties. Enzymatic modification of polysaccharide was considered the most potential method, because of the advantages of high safety, mild reaction conditions, eco-efficiency and green chemistry. The present article comprehensively reviews the enzymatic modification (hydrolysis and covalent grafting) of polysaccharides using several well-known enzymes, including polyphenol oxidase, peroxidase transglutaminase, lipoxygenase and so on. Particular emphasis was presented about the sorts of enzyme, the grafting methods and the reaction types. The impact of modification on the functional properties and the applications of polysaccharide derivatives were discussed.

polysaccharides, enzymatic modification, functional properties

TS201.2

A

1003-0174(2017)12-0134-07

国家自然科学基金(31371835)

2016-11-28

王迪，女，1992年出生，硕士，功能配料与食品添加剂

高彦祥，男，1961年出生，教授，博士生导师，功能配料与食品添加剂

勘误

《中国粮油学报》2017年第32卷第11期《山茶籽油研究应用进展》第191页左下角的作者信息有误，应为作者简介：李雪，女，1991年出生，硕士，营养与功能食品。通讯作者：白新鹏，男，1963年出生，教授，粮食、油脂及植物蛋白工程；谭运寿，男，1963年出生，粮食、油脂及植物蛋白工程。