LC-AFS联用测定形态硒流动相的选择

庄宇 辽宁省辽阳市疾病预防控制中心理化检验科 （辽宁 辽阳 111000）

LC-AFS联用测定形态硒流动相的选择

庄宇 辽宁省辽阳市疾病预防控制中心理化检验科 （辽宁 辽阳 111000）

研究液相色谱与原子荧光联用测定硒化合物形态时流动相对三个形态硒的分离情况和灵敏度的影响。实验确定了最佳的流动相为5 mmol/L柠檬酸（pH=4.5）。在优化的测定条件下，硒代胱氨酸（SeCys），四价硒（SeⅣ），硒代蛋氨酸（SeMet）三种形态的硒化合物能够在10min内被很好的分离，其保留时间分别为硒代胱氨酸3.106min，亚硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。以5 mmol/L柠檬酸（pH=4.5）作为流动相对茶叶样品中的硒化合物形态进行了分析。

LC-AFS 硒 形态分析 流动相

作为人体必需的微量营养元素之一，硒能够参加人体的多种代谢过程，在机体抗癌、抗氧化等方面发挥着重要作用。而不同形态的硒化合物对人体的作用不一致，其在动物体内的生物利用度、有效性、毒性以及代谢规律等不仅与硒的总量有关，而且与硒存在的化学形态密切相关。科学家们建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法，原子吸收光谱法等方法来研究硒的形态[1,2]。近年来，随着原子荧光联用技术的发展，科学家们逐渐开始利用液相色谱与原子荧光联用技术来测定硒化合物形态，并对其测定条件进行了优化[2,3]。但这些报道中所用的流动相均为NH4H2PO4溶液，本文尝试以5mmol/L，pH=4.5的柠檬酸作为流动相来实现对形态硒的分离，取得了令人满意的结果。

1.资料与方法

1.1 临床资料

设备仪器：SK-乐析-LC液相色谱原子荧光联用仪（北京金索坤技术开发有限公司），配汞高性能空心阴极灯。DT-501A电子天平（常熟市金羊砝码有限公司）；色谱柱（安捷伦科技有限公司）；PHS-2F型台式pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

条件：负高压设置为240V，灯电流80mA，载气和辅气流速分别为600mL/min和800mL/min，原子荧光泵转速100r/min，形态泵转速50r/min，进样体积为100μL。

试剂：盐酸（优级纯），过硫酸钾（优级纯），氢氧化钾（优级纯），硼氢化钾（分析纯），柠檬酸（分析纯），氨水（分析纯），硒标准溶液（国家环境保护总局标准样品研究所）。

本实验所用水均为去离子水。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

10%盐酸（体积比）：量取50mL盐酸，缓慢加入450mL水中。

0.5 %氢氧化钾-1.5%硼氢化钾：分别称取2.5g氢氧化钾，7.5g硼氢化钾，溶于500mL水中。

2%盐酸-3%过硫酸钾：量取10mL盐酸，缓慢加入490mL水中，再称取15.0g过硫酸钾溶于该溶液中。

5mmol/L的柠檬酸：称取0.525g柠檬酸，溶于500mL水中，用氨水调节pH值分别为3.5，4.0，4.5，5.0，过0.22µm的水系滤膜。

10mmol/L的柠檬酸：称取1.05g柠檬酸，溶于500mL水中，用氨水调节pH值为4.5，过0.22µm的水系滤膜。

20mmol/L的柠檬酸：称取2.10g柠檬酸，溶于500mL水中，用氨水调节pH值为4.5，过0.22µm的水系滤膜。

标准储备液的配置：

分别称取10mg硒代胱氨酸，硒带蛋氨酸，四价硒于3个50mL容量瓶，先加入40mL水，再加入2滴1:1盐酸，最后再用水定容至刻度，分别配制成浓度为200μg/mL的三种硒化合物溶液，以硒计浓度为别为43.3μg/mL，39.4μg/mL和42.9μg/mL。

分别移取24μL的亚硒酸根标准溶液，250μL的硒带蛋氨酸标准溶液和21μL的硒代胱氨酸于10mL容量瓶中，用水定容。此时，亚硒酸根和硒代胱氨酸的浓度为100ng/mL，硒代蛋氨酸的浓度为1μg/mL。将其逐级稀释，分别得到亚硒酸根，硒代胱氨酸浓度为0，10，20，40，80，100ng/mL，硒代蛋氨酸的浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0μg/mL的标准系列溶液。

进样量100μL。

1.2.2 样品前处理

按照文献[4]报道的方法，对市售茶叶样品进行前处理。准确称取0.5g样品于15mL离心管中，加入10mL体积比1:1的盐酸作为提取液，混合均匀，超声波超声20min，再在12000r/min条件下离心10min，用0.22μm滤膜的针头滤器过滤上清液，同时制备空白液[5]。稀释滤液，检测Se形态。

2.结果与讨论

2.1 流动相pH值对保留时间和灵敏度的影响

保持流动相中柠檬酸的浓度为20mmol/L，改变溶液的pH，当流动相的pH值改变时，对亚硒酸根和硒代蛋氨酸的保留时间和灵敏度有影响。随着pH增大，亚硒酸根与硒代蛋氨酸的保留时间逐渐减小；亚硒酸根的灵敏度逐渐增加，而硒代蛋氨酸的灵敏度有所下降。当pH由4.5增加至5.0时，亚硒酸根的灵敏度不再增加。但是pH对亚硒酸根保留时间和灵敏度的影响更明显。

2.2 柠檬酸浓度对保留时间和灵敏度的影响

流动相中柠檬酸的浓度对三种硒形态化合物的分离效果的影响结果，不同浓度的柠檬酸只对Se（IV）的保留时间和灵敏度有显著影响，而对另外两种形态硒的保留时间影响不大。随着柠檬酸浓度的增加，Se（IV）的保留时间逐渐减小，灵敏度逐渐增加。而硒代蛋氨酸的保留时间略有减小，灵敏度逐渐增加。

2.3 方法学测试

优化后的浓度为100ng/mL（硒代蛋氨酸浓度为1000ng/mL）的三种形态硒化合物的液相，三种形态硒可以在10min以内完全分离。其保留时间分别为：硒代胱氨酸3.106min，亚硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。

用实验中优化的流动相对三种形态硒化合物的混合标准溶液系列进行线性回归实验，并平行测定7次浓度为100ng/mL（硒代蛋氨酸浓度为1.0μg/mL）的混合标准溶液。

2.4 样品分析

用实验中优化的测试条件对茶叶样品中三种硒的含量进行分析，并进行加标回收实验。样品平行测定3次，结果加标回收率在90.7%～93.5%。

3.结论

本文选择了以柠檬酸为流动相检测形态硒，探究了流动相中柠檬酸浓度以及pH值对三种形态硒的分离度及灵敏度的影响，选定了最佳的流动相为5mmol/L柠檬酸（pH=4.5）。将三种形态硒的检测时间控制在10min之内，保留时间分别为：硒代胱氨酸3.106min，亚硒酸根4.603min，硒代蛋氨酸7.713min。该方法对检测食品中硒形态化合物具有实际应用价值。

[1] 中华人民共和国国家标准.GB 5009.93-2010,食品安全国家标准食品中硒的测定[S].2010.

[2] 中华人民共和国地方标准.DB 3301/T 117-2007.稻米中有机硒和无机硒含量的测定原子荧光光谱法[S].2007.

[3] 王欣,幸苑娜,陈泽勇,等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测富硒食品中6种硒形态[J].分析化学,2013,41(11):1669-1674.

[4] 王丙涛,谢丽琪,林燕奎,等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测食品中的五种硒形态[J].色谱,2011,29(3):223-227.

[5] 姚晶晶,袁友明,王明锐,等.高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光法测定茶叶中的3种硒形态[J].现代农业科技,2015,42(21):297-298.

Selection of LC - AFS for the Determination of Selenium Mobile Phase

ZHUANG Yu Physical and Chemical Laboratory, Liaoyang Center for Disease Control and Prevention of Liaoning Province (Liaoning Liaoyang 111000)

1006-6586(2017)21-0026-02

TS207.3

A

2017-04-11