不同生态环境烤烟品种碳氮代谢关键酶活性及其与致香物质的关系

杨志晓，王轶，王志红，史跃伟，谢升东，王仁刚，郭玉双，任学良，杨铁钊

（1.贵州省烟草科学研究院烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵州贵阳550081；2.河南农业大学烟草学院，河南郑州450002）

不同生态环境烤烟品种碳氮代谢关键酶活性及其与致香物质的关系

杨志晓1，王轶1，王志红1，史跃伟1，谢升东1，王仁刚1，郭玉双1，任学良1，杨铁钊2*

（1.贵州省烟草科学研究院烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵州贵阳550081；2.河南农业大学烟草学院，河南郑州450002）

在贵州兴义、凤冈和贵定3个生态环境种植烤烟品种红花大金元、K326，研究不同生态环境下烤烟品种碳氮代谢关键酶活性及其与致香物质的关系。结果表明，在烟叶生长发育过程中，硝酸还原酶活性持续降低，而蔗糖转化酶表现为先上升后下降的变化趋势，不同生态环境、品种间的碳氮代谢关键酶活性差异明显。生态环境、品种及其互作均对致香物质、感官评吸质量产生影响，其中生态环境、因素的作用效应较大。相关分析结果显示，烤烟致香物质总量受到移栽后35、50，65d与80 d的NR/INV的影响，且除65 d外，其影响效应均达到极显著水平。NR/INV与烟叶感官评吸质量各指标无明显直线相关关系，但各感官评吸质量指标及评吸质量总分均与某一时期或者几个时期的NR/INV的相关性分别达到差异显著或者极显著水平。

烤烟；生态环境；碳氮代谢；酶活性；致香物质；相关分析

致香物质是构成烟叶香气质量的重要因素，也是评价烟叶内在质量的核心内容[1、2]。与国外优质烤烟相比，香气质差、香气量不足是影响我国烟叶质量的关键性因素[3]。相关研究指出，碳氮代谢是烟株体内最基本的代谢途径，其代谢强度、协调程度及其在烟叶生长发育过程中的动态变化均能影响致香物质的含量和组成比例，对烟叶品质产生重大影响；碳氮代谢失调、香气质差、香气量不足，会导致烟叶质量下降[4、5]。因此，深入研究碳氮代谢机理，探明烟叶碳氮代谢与致香物质的转化、形成规律，并提出相应的发展策略，对提高烟叶质量具有重要意义。

生态环境和品种是影响香气物质的关键因子，目前学界对外界生态环境因素及品种对烤烟致香物质的影响开展了大量研究[6-8]，但关于碳氮代谢关键酶在不同生态环境和不同烤烟品种间的活性动态变化及其与致香物质的关系研究报道较少。因此，本文选择贵州中间香型3个典型生态环境，以烤烟品种K326、红花大金元为材料，对不同生态环境下烤烟品种间的碳氮代谢关键酶变化规律进行研究，阐述烟叶碳氮代谢与致香物质、感官评吸质量的关系，旨在为进一步彰显中间香型特色烟叶质量风格与生产符合中式卷烟质量要求的优质烟叶，提供更加科学的理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2010-2011年在贵州省兴义市、凤冈县与贵定县进行田间试验，以我国主栽烤烟品种K326和红花大金元为试验材料。3个试验点均采用大区种植，面积为15亩（1亩≈666.7 m2），2个品种的可采叶数均是20片，大田施肥以及其他各种田间操作均依照本地优质烤烟技术规程开展。试验地地势平整并且排灌便利，光照充足，肥力中等，植烟土壤类型一致。

3个试验点生态环境基本情况如下：兴义试验点土壤类别为黄棕壤，土壤基础肥力分别是：pH 7.7，有机质41.29 g·kg-1，速效氮154.27 mg·kg-1，速效磷23.98 mg·kg-1，有效钾361.52 mg·kg-1，海拔1 551 m，年均气温13.6～19.1℃，5-8月日照时数为600～700 h，年降雨量1 200～1 600 mm，无霜期281～348 d。凤冈试验点土壤类别为黄砂土，土壤基础肥力分别为：有机质15.33 g·kg-1，速效氮80.21 mg·kg-1，速效磷15.98 mg·kg-1，速效钾108.92 mg·kg-1，pH 7.6，海拔685 m，年均气温13.8～15.6℃，5-8月日照时数为450～500 h，年降雨量1 100～1 300 mm，无霜期260～315 d。贵定试验点土壤类别为黄壤土，土壤基础肥力分别是：有机质15.77 g·kg-1，速效氮82.96 mg·kg-1，速效磷16.25 mg·kg-1，有效钾101.65 mg·kg-1，pH 7.5，海拔1 114 m，年均气温13.6～15.1℃，5-8月日照时数为500-550 h，年降雨量1 100～1 300 mm，无霜期260-320 d。

1.2 试验设计

在移栽后20 d，分别选择具有典型代表性的2个品种烟株各300棵，进行挂牌标记。分别在移栽后35、50、65和80 d时选取第10叶位叶片（从下向上数），鲜样取下后立即用液氮冷冻带回实验室，存于-80℃冰箱，用于各项生理指标的测定。

烟叶进入成熟期后，按照不同品种分别采收与烘烤。烘烤结束后，分别取2个品种2 kg C3F等级的烤后烟叶，进行致香物质测定与感官质量评价。

1.3 测定内容与方法

1.3.1 碳氮代谢关键酶活性测定

采用活体法测定硝酸还原酶活性[9]；依照3，5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖转化酶活性[10]，每个指标重复测定3次。

1.3.2 致香物质测定

使用HPl 5890-5972气质联用仪（GC/MS）提取致香物质并进行定性定量分析。将烟叶样品除去主脉后，置于40℃烘箱中烘干至含水率为7%～8%，粉碎后过0.25 mm孔网筛。对烟样利用水蒸气蒸馏——二氯甲烷溶剂萃取法进行前处理[11]。首先，分别称（量）取10.0 g烟样、1.0 g柠檬酸和350 mL蒸馏水以及302 g·mL-1硝基苯内标液0.5 mL置于500 mL圆底烧瓶内。此后进行同时蒸馏萃取设备安装，将内含二氯甲烷40 mL的250 mL烧瓶置于冷凝管上端，利用水浴锅进行加热，待装置内分层现象开始出现后进行计时，蒸馏萃取反应持续2.5 h。结束后对提取的有机相进行收集，加入10.0 g无水硫酸钠进行干燥，此后将有机相转移至鸡心瓶，对有机相采用60℃水浴加热浓缩到1 mL左右。利用GC/MS鉴定结果与NIST库（NIST 98、Wiley 275）对分析样品进行检索和定性。结果按照内标法计算，校正因子为1，并用峰面积归一化法对致香物质进行半定量分析（RSD＜5%）。

GC/MS分析参数分别如下：色谱柱条件为HP-5（60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）；载气为He，流速达到0.8 mL·min-1；进样口、传输线温度分别为250℃和280℃；离子源温度为177℃。GC/MS升温设定为初温50℃，保持恒温2 min，然后以2℃·min-1的速度增温到120℃，保持5 min，此后再以同样的升温速度达到240℃并持续30 min；分流比设置为1∶15，每次进样2 μL；电离能为70 eV；质量数在50～500 Da的区间变化；MS谱库为NIST02，利用内标法进行定量。

1.3.3 感官质量评吸对烤后烟叶样品回潮，然后切丝制成单料烟，由贵州中烟工业公司相关专家参照“YC/T 138-1998烟草及烟草制品感官评吸方法”进行感官质量评吸。感官质量评吸指标分别为香气量、香气质、杂气、余味和刺激性，上述指标均采用9分制标准进行打分（表1），且相对权重依次为0.30、0.30、0.17、0.15和0.08。按照以下公式计算感官质量评价得分：

式（1）中：P为感官质量评价综合得分；Ci为第i个感官质量评价的量化得分；Pi为第i个感官质量评价的相对权重）。

表1 烤烟感官质量评价评分标准Table 1 Evaluation standard for the quality of sensory smoking of flue-cured tobacco

1.4 数据统计和分析

应用Excel 2010对数据进行整理、绘图。使用SPSS 17.0统计软件对数据开展多重比较与方差分析。利用DPS 6.55分析软件进行逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同生态环境烤烟品种间碳氮代谢关键酶活性变化

2.1.1 硝酸还原酶的活性动态变化

硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）属于氮代谢的关键酶与限速酶，同时能够直接反映氮素反应活性高低。NR可以作为诱导酶将硝酸盐催化还原成亚硝酸盐，然后在亚硝酸还原酶作用下被还原成为铵盐，能够被植物吸收利用而促进生长发育[12]。由表2可以看出，各个生态环境全生育期烟叶中的NR活性均表现为一直下降的变化趋势。在移栽后第35 d时，3个生态环境烟叶间的NR活性差异显著。在第50 d时，凤冈点烟叶的NR活性最高，分别是兴义、贵定点烟叶NR活性的1.39倍、1.56倍，且差异达到显著水平；而在第65 d时，贵定点烟叶的NR活性最低，和兴义和凤冈点的差异均呈显著水平；进入第80 d时，兴义点烟叶的NR活性显著高于凤冈和贵定点，分别是凤冈、贵定点烟叶活性的1.88倍、2.1倍，而凤冈和贵定点烟叶的NR活性则无明显差异。经过对3个生态环境中烟叶生长发育过程内的NR活性动态变化进行对比分析，结果显示，整个生育期内，兴义和贵定点烟叶的NR在移栽后第35-50 d均下降最快；而凤冈点则以移栽后第50-80 d的NR降幅明显。

表2 烤烟生长发育过程中硝酸还原酶活性变化（μg·g-1·h-1）Table 2 Changes of nitrate reductase activity in flue-cured tobacco at different ecological environment

2个品种烟叶的NR活性也有差异性。如图1所示，在移栽后第35、50和65 d，品种烟叶间NR活性表现为K326＞红花大金元，而在第80 d，则表现为红花大金元＞K326。

图1 不同烤烟品种硝酸还原酶活性变化Fig.1 Changes of nitrate reductase activity in different flue-cured tobacco cultivars

2.1.2 蔗糖转化酶活性的动态变化

蔗糖转化酶（Invertase，INV）是作物重要的糖代谢酶，可促进叶绿体往外转运磷酸丙糖，以减少叶绿体内的淀粉积累量，同时与呼吸作用相偶联进行氧化磷酸化反应而生成能量，从而增强光合碳固定活动，所以INV活性高低能够反映碳代谢活动的强弱[13]。由表3可以看出，3个生态环境条件下的烤烟INV活性均表现出先上升后下降的变化趋势；兴义、贵定点均在移栽后第50 d出现最大值，而凤冈点则在第65 d达到峰值。在第35 d时，以兴义点的INV活性最高，凤冈点最低，兴义点的INV活性分别是凤冈、贵定点的1.15倍、1.1倍，且差异达到显著水平，而凤冈和贵定点的INV活性则无明显差异。进入第50 d时，以贵定点的INV活性最高，凤冈点次之，兴义点的活性最低，贵定点的INV活性为兴义点的1.14倍，差异达到显著水平。在第65、80 d时，3个试验点间的INV活性差异水平均达到显著，且兴义点的INV活性均最低。凤冈点的INV活性在第65 d时最高，贵定点次之，凤冈、贵定点的INV活性分别是兴义点的1.53倍、1.33倍；而第80 d时，贵定点的INV活性最高，高于凤冈点，贵定、凤冈点的INV活性分别是兴义点的1.46倍、1.34倍。

表3 烤烟生长发育过程中蔗糖转化酶活性变化（mg·g-1·h-1）Table 3 Changes of invertase activity in flue-cured tobacco at different ecological environment(mg·g-1·h-1)

从图2可以看出，在第35 d和65 d时，红花大金元的INV活性高于K326；而在第50和80 d时，品种间INV活性均表现为K326＞红花大金元。

图2 不同烤烟品种蔗糖转化酶活性变化Fig 2.Changes of invertase activity in different flue-cured tobacco cultivars

2.2 不同生态环境烤烟品种间致香物质含量差异

由表4可知，3个生态环境烟叶致香物质含量的变异范围为663.34～846.23 μg·g-1，变异系数为17.43%，以凤冈点的致香物质含量最多，贵定点含量最低。2个烤烟品种致香物质含量在769.76～839.39 μg·g-1的范围内变化，变异系数达到6.16%，以红花大金元致香物质含量最高。结果表明，烟叶致香物质含量在不同生态环境、品种间差异较大。

表4 烤烟致香物质含量差异（μg·g-1）Table 4 Contents difference of aroma components in flue-cured tobacco at different ecological environment

烤烟致香物质的变异来源如表5所示。

2.3 不同生态环境烤烟品种间感官评吸质量分析

试验结果（表6）表明，生态环境因素对感官评吸质量的各项指标均有显著影响。兴义点烟叶的香气质、余味、杂气、刺激性及评吸总分均显著高于凤冈、贵定点，而贵定点烟叶的香气量、劲头均显著高于凤冈点。品种对烟叶的香气质、余味以及刺激性有显著影响，对香气量、劲头、杂气及总分无显著影响，总体上，红花大金元感官评吸总分略高于K326。

表6 烤烟感官评吸质量分析Table 6.Analysis of the quality of sensory smoking in flue-cured tobacco at different ecological environment

由表7可知，生态环境对刺激性的贡献率最大，为28.02%；对香气量的贡献率最小，仅为8.43%。品种对刺激性的贡献率最大，是5.66%；对劲头的贡献最低，仅为0.77%。互作效应对劲头的影响最大，贡献率是82.99%，其次是香气量达81.78%；而对香气质的影响最小，贡献率仅为51.51%。从整体来看，互作效应对感官评吸质量各个指标的贡献率最大，变异范围为51.51%～82.99%；其次是生态环境因素，变异范围是8.43%～28.02%；品种的影响最小，变异范围为0.77%～5.66%，说明烤烟感官评吸质量受到生态环境和品种的综合作用。

表7 生态环境、品种对感官评吸质量的贡献率（%）Table 7 Contribution rate of ecological environment and cultivar to the quality of sensory smoking（%）

2.4 碳氮代谢与烤烟致香物质的关系

对烤烟移栽后不同时期的硝酸还原酶与蔗糖转化酶的活性比（NR/INV）和致香物质总量进行逐步回归分析，设Y为致香物质总量，X1-X4分别为移栽后第35-80 d的NR/INV测定值。

分析结果表明，拟合模型方差分析检验达到显著或极显著差异水平的NR/INV变量有X4（80 d）、X1（35 d）和X2（50 d），并得出回归方程（见表8）。在所考察的4个取样时期的NR/INV测定值中，第35、50和80 d的NR/INV测定值对烟叶致香物质总量的影响效应达到极显著水平，表明烟叶移栽后第35、50和80 d的NR/INV测定值变化是影响致香物质的关键因素之一。其中第80 d的NR/INV与致香物质总量呈极显著正相关关系，而第35、50 d的NR/INV和致香物质总量均呈极显著负相关关系。

表8 NR/INV与致香物质回归系数及显著性检验Table 8 Regression coefficient and significance test of NR/INV and aroma components in flue-cured tobacco at different ecological environment

2.5 碳氮代谢与烤烟感官评吸质量的关系

分别对移栽后不同时期的NR/INV测定值与感官评吸质量进行相关分析。结果表明（表9），移栽后各时期烟叶的NR/INV与烟叶感官评吸质量各指标无明显直线相关关系，仅有刺激性与除第50 d外其他各时期的NR/INV呈负相关关系，但显著性较差。香气量与烟叶发育过程中不同时期的NR/INV关系密切，在第35、65和80 d的相关性都达到显著或极显著水平，且均呈负相关关系。香气质与各时期的NR/ INV的相关性不明显，仅和第35 d时的NR/INV呈显著负相关关系。杂气与第50、80 d时的NR/INV分别呈极显著、显著正相关关系。劲头和第35 d的NR/INV达到极显著负相关关系，而与第50 d时的NR/INV呈显著正相关关系。余味与各时期的NR/INV的相关性不明显，仅和第50 d时呈显著负相关关系。对感官评吸质量总分影响较大的分别是移栽后第35 d和65 d时的NR/INV测定值，其中第35 d时的NR/INV与评吸质量总分达到极显著正相关关系，但第65 d时的NR/INV与总分呈显著负相关关系。

表9 NR/INV与感官评吸质量的相关分析Table 9 Correlation analysis of NR/INV and aroma components in flue-cured tobacco at different ecological environment

3 结论与讨论

碳氮代谢是烟草生长发育最基本的代谢活动，NR和INV在其中起着至关重要的作用。本试验研究表明，NR活性在烤烟全生育期呈下降趋势，这与拓阳阳的研究结果相一致[14]。在移栽后第35-50 d，凤冈烟叶NR活性明显高于其他2个试验点，显示出其对硝态氮利用具有一定的优势，有利于满足烟叶生长发育的营养需求；而在第65-80 d时，以兴义点NR活性较高。在不同生态环境条件下，2个不同品种的NR活性变化趋势基本一致，K326的NR活性在第35-65 d时较高，表明此时期K326的代谢活动旺盛，有利于满足烟株生长发育；而在80 d时，红花大金元活性高于K326，此时NR活性较高，导致烟叶贪青晚熟，不利于烟叶内在品质形成。这可能是红花大金元烟叶成熟期不易落黄的重要原因。烤烟生长过程中的INV活性在不同生态环境和品种间均表现为先增加后下降的变化趋势。兴义、贵定点的INV活性在第50 d时达到最大值，而凤冈点则在第65 d时出现峰值。进入成熟期后，不同品种的NR、INV活性在3个生态环境均呈下降趋势，表明此时期烟株氮素代谢强度下降，由对碳素的固定、转化转变成对碳素的降解、积累为主，有助于碳氮代谢平衡、协调，从而保证烟叶内在质量。

生态因素决定烟叶质量风格类型，品种受外界生态环境与当地生产条件的影响较大，优良品种只有在适宜地区种植才能具有较高的商品价值和工业可用性[15、16]。本文研究结果表明，生态环境、品种及其互作均对致香物质、感官评吸质量产生作用，其中生态环境因素影响大于互作效应和品种的作用，说明不同生态环境条件对烤烟致香成分、感官评吸质量发挥的综合影响效应最大[17、18]。周淑平研究指出，初烤烟叶的致香成分受生态条件的影响作用较大[19]，本文与其研究结论相一致。烤烟品种间致香物质的差异性可能导致不同品种具有不同的香型风格[20]。在本文中，红花大金元、K326含有相同种类的致香物质成分，但含量却有较大差异，从而导致2个品种表现出不同的香气质量风格，以红花大金元的致香物质含量最多，K326含量较低，这与红花大金元感官评吸总分较高的研究结果相一致。这表明可以通过选育适宜当地生态环境特点的特色优质品种来调控烤烟的致香物质和感官评吸质量，提高烟叶品质。

烟叶是以品质取胜的作物，品质的优劣与烤后烟叶的致香物质含量高低以及感官评吸质量好坏具有密切关系[20]。不同时期的物质代谢类型和水平密切相关。对不同生态环境、不同品种的碳氮代谢与烤烟致香物质、感官评吸质量进行回归分析结果显示，移栽后第35、50和80 d的NR/INV测定值对烟叶致香物质的影响效应达到显著或极显著水平，表明该时期烟叶内的碳氮代谢活动显著影响致香物质的合成、积累。可以通过调控碳氮代谢反应平衡状态以改善烟叶致香物质含量以及感官评吸质量，提高烟叶的品质。

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[责任编辑：向晚]

Analysis on Dynamic of Key Enzymes Activity Involved in Carbon and Nitrogen Metabolism and Correlation with Aroma Components among Cultivars of Flue-cured Tobacco in Different Ecological Environment

YANG Zhi-xiao1,Wang Yi1,WANG Zhi-hong1,SHI Yue-wei1,XIE Sheng-dong1, Wang Ren-gang1,Guo Yu-shuang1,REN Xue-liang1,YANG Tie-zhao2*

（1.Key Laboratory of Molecular Genetics,Guizhou Academy of Tobacco Science,Guizhou Guiyang 550081,China;2.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Henan Zhengzhou 450002,China）

The dynamic of key enzymes activity involved in carbon and nitrogen metabolism in different flue-cured tobacco cultivars were studied with the tested materials of K326 and Honghuadajinyuan(Nicotina Tabacum L.)in field conditions at Xingyi,Fenggang and Guiding of Guizhou,and the correlation with aroma components was also investigated.The results showed that the activity of nitrate reductase continued to decline, whereas the invertase activity increased at the earlier stage and decreased at later in the growth and development period.There were significant differences of key enzymes activity among different genotypes in three ecological environment.Ecological environment conditions,varieties and their interactions all had impacts on aroma components and the quality of sensory smoking,and the effects of ecological environment conditions were greater.The correlation analysis results revealed that the aroma components had significant or extremely significant correlation with NR/INV of 35 d,50 d and 80 d after transplanting.There was no significant linear correlation between thequality of sensory smoking and NR/INV,but the each indicator of the quality of sensory smoking and the total score of smoking quality showed significant or highly significant correlations with NR/INV at one or several stages after transplanting.

Flue-cured tobacco;ecological environment conditions;carbon and nitrogen metabolism;enzyme activity;aroma components;relationship analysis

S572.01

A

2096-2347（2016）03-0032-08

10.19478/j.cnki.2096-2347.2016.03.05

2016-06-20

国家自然科学基金项目（31360431）；国家烟草专卖局科技重点项目（110201002003）；贵州省烟草公司遵义市公司项目（201420）。

杨志晓（1981—），男，贵州贵阳人，博士，副研究员，主要从事烟草遗传育种研究。E-mail：linyingxian2006@126.com

*[通讯作者]杨铁钊（1956—），男，河南临颍人，教授，博士生导师，主要从事烟草遗传育种研究。E-mail：yangtiezhao@126.com