基于文献研究的生物多糖提取中的分离纯化技术研究综述

刘淑梅* 李芳蓉陈军

（1甘肃中医药大学定西校区生化系，甘肃 定西 743000）（2甘肃中医药大学定西校区物电系，甘肃 定西 743000）项目号：定西师范高等专科学校资助项目（No.TD2016ZD05）

基于文献研究的生物多糖提取中的分离纯化技术研究综述

刘淑梅* 李芳蓉1陈军2

（1甘肃中医药大学定西校区生化系，甘肃 定西 743000）（2甘肃中医药大学定西校区物电系，甘肃 定西 743000）项目号：定西师范高等专科学校资助项目（No.TD2016ZD05）

存在于动植物及微生物组织中的某些生物多糖，因具有促进机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、降低血脂以及改善动物生产性能等一系列生物活性作用而成为二十一世纪的研究热点。其中，获取单一、纯净的生物多糖是生物多糖功效研究的基础。本文基于文献研究的基础上，综述多糖提取中去除多种非多糖杂质组分的技术，为多糖分离纯化提供一定的技术支持。

生物多糖；分离纯化；研究；综述。

1 、引言

多糖既是生物体的能源物质，也是生物体的结构物质，还参与多种重要的生命活动。生物多糖是蕴藏生命奥秘和主宰生命活动的三类生物大分子（核酸、蛋白质和多糖）之一，但多糖的研究层次和水平远远落后于核酸和蛋白质（姜辉）。自1988年，牛津大学的几位教授首次提出了“糖生物学”的概念之后，日本、美国、欧盟分别开启了关于多糖的研究计划。日本科学家们提出了关于“糖工程基础与应用研究推进战略”方案，并预定在1991年实施“糖工程前沿计划”；美国启动了“功能糖组学计划”；欧盟启动了“欧盟糖研究与开发平台”。日本学者认为：以多糖结构、功能和应用为核心的糖工程是继蛋白质工程和基因工程之后生物化学和分子生物学领域中最重要的科学前沿，提出人类对多糖的深入认识将有助于进一步认识自身，并预言了糖生物学的到来，预示21世纪将是多糖生命科学的时代(Joseph A2001;Jian X et al.,2003)。《Scienctific American》对多糖报道时称“没有蛋白质就没有生命，但是没有多糖没有活力”，高度概括了多糖对于生命活动的重要性。

多糖虽然广泛存在于生物机体内，但往往与其他物质紧密结合形成结构复杂的复合物，所以，从有机体组织中提取的粗多糖，不同程度的混有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物(如低聚糖)等杂质，获得单一组分的多糖是多糖提取中研究的重要内容之一，也是多糖生物学功效研究的基础。本文在大量研读相关文献的的基础上，综述多糖提取中的分离纯化技术。

2 、多糖提取中的分离纯化

多糖的分离纯化，就是将粗多糖中的非多糖组分杂质性质采取相对应的分离措施。

2.1 蛋白的脱除

生物细胞膜上的多糖大多与蛋白质结合形成糖蛋白，所以提取的细胞膜多糖中含有一定量的蛋白质。脱除蛋白质就是利用蛋白质与多糖成分在不同溶剂中的特性除去蛋白质或者溶出多糖。传统的方法有机溶剂法、酶法与Sevage法联用[1]、树脂柱层析法和等电点法[2]等。较为常用的有：

2.1.1.有机溶剂法

如氯仿-正丁醇(Sevage)法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等。

氯仿-Sevage法 是利用蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，将氯仿与正丁醇（或正戊醇）按4:1比例混合后，再与多糖提取液等体积混合，之后反复振摇10min，蛋白质变性成胶状，存在于水相和溶剂的交界面上，然后离心，取上层糖液重复上述操作，直至无蛋白析出为止。Sevag法是经典的去除蛋白的方法，作用条件较温和，可避免多糖的降解，但需要多次处理才能除净蛋白质，费时费力，且多糖和有机溶剂损耗较大。

三氯乙酸法[3]是在粗多糖液中加入三氯乙酸使其浓度达到10%[4] ，4℃条件下放置过夜，离心，弃沉淀。三氯乙酸法脱蛋白效率较高，浓度越大、除蛋白质效果越好，但三氯乙酸易造成糖苷键断裂，使多糖发生降解，且多糖损失随三氯乙酸浓度增大而增大。

三氟三氯乙烷法[5]，将多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合，在4℃下搅拌10min左右，蛋白质成胶冻状，离心得上层溶液，上层溶液继续用上述方法处理几次，即得无蛋白的多糖溶液。有机溶剂法去除蛋白质溶剂容易残留，为了提高效率，减少试剂使用。

2.1.2 酶法与Sevage法联用

多糖提取液中加入2%的胰蛋白酶[6]，在37℃恒温水浴锅中温浴两个小时，然后用Sevage法脱蛋白，直至无蛋白析出。酶法与Sevage法联用较之Sevage法效率高、有机溶剂损耗少。等电点法脱蛋白用1mmol.L-1盐酸调节多糖提取液pH值至3，4℃条件下放置过夜，离心，弃沉淀得脱蛋白液。

2.1.3 树脂柱层析法分离脱蛋白是近些年常用的脱蛋白技术。

树脂柱层析法分离技术脱蛋白，不仅除蛋白效果好，而且多糖回收率较高、处理条件温和、操作简便、洗脱液为蒸馏水，较好保持了多糖的生物活性[7]。

2.2 脱色

植物多糖提取物中常含酚类物质，因氧化而生成色素，影响多糖的色谱分析和性质测定。根据色素性质不同，可用氧化剂、吸附剂、离子交换剂等脱除。氧化剂常为双氧水，双氧水是通过氧化色素物质而脱色，却不能除去色素物质，需要进一步采取措施才能去除。使用双氧水要注意:双氧水是强氧化剂，浓度过高会引起多糖的降解和结构的变化。用吸附剂、离子交换剂等脱除色素，方法比较温和。吸附剂有纤维素、聚酰胺、活性炭、大孔树脂、硅藻土、高岭土等[8][9]，其中树脂和聚酰胺脱色效果较好，且不易造成多糖大量流失，活性炭对多糖吸附较为严重，损失较大。目前最常用是以二乙氨乙基纤维素(DEAECellulose)为离子交换剂的脱色方法[10]，因为对酸性多糖的吸附力强，而造成损失多，提取酸性多糖不宜。树脂柱层析法不仅能达到脱色的目的，而且可以实现多糖、核酸、中性和酸性蛋白等的分离，其应用前景广泛。方积年实验室又发明了一种新的多糖脱色方法，即采用十六烷基三甲基溴化铵-正己醇-异辛烷组成的反胶束溶液，在一定的盐浓度下，对多糖粗品进行脱色，此方法已获得专利。对于脱色方法的选择，可依据多糖的组成，性质和产品的用途，选择合适的脱色方法。

2.3 去脂

为了除去多糖中的脂类成分，提取之前可以先用甲醇-氯仿、石油醚、丙酮等除去脂肪酸等脂溶性成分。或者是提取后用水不溶的有机溶剂如氯仿等进行萃取，以除去脂溶性化合物。也可以采用碱性水解，使脂类分解，再透析去除分解产物[11]。

2.4 脱小分子杂质

透析是去除无机盐等小分子的有效手段，将多糖溶液放入一定截留分子量的透析袋中，在自来水或蒸馏水中透析，无机盐、单糖、低聚糖、氨基酸和部分色素等小分子物质渗出透析膜，而大分子物质仍保留在溶液中，该方法操作简单，但处理量少，操作时间较长。

3 、多糖的分级纯化研究

经过除杂后的多糖仍是混合物，其化学组成、聚合度、分子形状等具有不一致性。要得到组成、聚合度、分子形状等一致的多糖组分，需对该混合物进行分级纯化。常用的分级方法有离子交换柱层析、超滤、凝胶柱层析法等。

3.1 离子交换柱层析

是目前多糖纯化中应用最广的一种方法，利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力(静电引力)而达到分离目的。对于体积较大的多糖溶液，大多采取阴离子交换柱层析纯化。使多糖得到初步纯化，甚至可以分离到一致性组分。应用最广泛的交换剂(填料)有二乙氨乙基纤维素(DEAE-Cellulose)、DEAE-葡聚糖(DEAE-sephadex)及DEAE-琼脂糖(DEAE-sepharose)三种，分为硼砂型和碱型，洗脱剂可用不同浓度碱溶液、硼砂溶液、盐溶液，其优点可吸附杂质、纯化多糖，并适用于分离各种酸性、中性多糖和黏多糖。如玉郎伞多糖[12]、蓝莓多糖[13]等的分离。离子交换柱分离糖类可先有效地去除多糖水溶液中的酸性成分，碱性成分和去除无机离子，所剩下的和糖苷继续分离，但不适合用强酸性和强碱性树脂。

3.2 超滤技术

是近年发展起来的膜分离技术，也叫透析法。此种方法的关键是要选择孔目合适的透析膜。如，纤维膜孔径为2-3nm，可使无机盐或单糖分子通过，使多糖与无机盐或单糖分子分离效果较好；孔径较大时(3-5nm)，透析加速，甚至可使双糖分子通过，可实现多糖与双糖的分离。该技术不易破坏多糖的生物活性、能耗低、环境污染，适于工业化生产，如中药多糖、海洋多糖、发酵多糖、食用植物多糖等[14]。但由于大多数超滤膜能吸附多糖，死体积大，使其得率大大降低。

3.3 凝胶柱层析

实际上起分子筛作用，是目前植物多糖最常用的高级纯化方法。当溶液通过网状结构的凝胶粒时，小分子物质自由扩散于凝胶粒的孔隙中，大分子物质则被排阻于凝胶粒外。在洗脱剂作用下，最大分子的物质最先流出，最后流出的洗脱液中含有最小分子的物质。依次分段收集洗脱液则可得到不同相对分子质量的物质。

在多糖分离纯化中常用的凝胶材料有葡聚糖凝胶系列(Sephadex)、丙烯葡聚糖凝胶系列(Sephacryl)、天然琼脂糖凝胶系列(Sepharose)以及上述凝胶的衍生物。实际应用中，常将DEAE-纤维素和葡聚糖凝胶联用，分离效果更好[15]。如化橘红多糖的分离纯化，沙棘多糖[16]等的纯化。

3.4 制备性高压液相色谱((HPLC)

HPLC是在经典柱层析原理的基础上，流动相以高压的方式注入柱内，样品组分就在流动相和固定相之间进行平衡分配，反复多次重复之后，样品组分彼此分离，并向下迁移，各组分的迁移速率与其和固定相之间的相对亲和力有关。

3.5 制备性区域电泳法

其原理是根据多糖分子的大小、形状及其所负电荷的不同而在电场中的作用力不同而达到分离。玻璃粉是通常的载体。这种方法虽然分离效果好，但效率比较低，大规模应用不太实际。

3.6 分步沉淀法

依据不同的多糖在低级醇或酮中具有不同溶解度而进行分离的。分子量大的多糖在乙醇或丙酮中的溶解度相对较小，因此改变乙醇或丙酮的浓度可分离出不同分子量的多糖。此法非常简便，在多糖纯化中常常使用，但是只适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖，并且最好将溶液pH值调到7.0附近，此时多糖的性质较稳定。如雪茶多糖提取时的乙醇分级沉淀来纯化。

3.7 盐析法

是根据各种多糖在不同盐浓度中具有不同的溶解度的特性进行分离各种多糖。可在多糖的水提液中加入无机盐，使其达到一定浓度或饱和，促使多糖在水中溶解度降低析出，与其他水溶性较大的杂质、多糖分离。盐析法有成本低的优点，但是效率不高易产生共沉淀，得到的多糖含有很多盐类，必须经过透析除盐。常用的盐有NaCl、KCl、(NH4)2SO4等，其中(NH4)2SO4方法最佳。如利用盐析法提取仙人掌中的果胶，且实验结果表明盐析法比乙醇沉淀法要好[18]。

3.8 季按盐沉淀法

季按盐是一种常用的阳离子表面活性剂，长链季按盐能与酸性多糖形成不溶性多糖化合物，从而达到分离纯化酸性多糖的目的，常用的季按盐有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十六烷基吡啶(CPC)。

多糖的分级纯化方法往往也可用于多糖的分离，使多糖的分离与分级纯化可以同时进行，或者先分离再纯化。一种分离、分级方法不能一次性地获得一致性组分，只有综合利用几种方法才能达到纯化的效果。

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A Summarization of Separation and Purification technology of Biological Polysaccharide Extraction Based on the Literature

LIU-Shumei1 LI-Fangrong1 CHEN-Jun2

(1.Department of Biochemistry, Dingxi Campus,GanSu University of Chinese Medicine ;2.Department of Physics and Electronic Engineering, Dingxi Campus,GanSu University of Chinese Medicine ,Dingxi Gansu 743000, China)

Exists in the plants and animals and microbes in the organization of some biological polysaccharide, for promoting the body immunity, antibacterial, antiviral, anti parasite, anti-tumor, anti-inflammatory, radiation resistance, anti-aging, reducing blood fat and improving animal production performance, and a series of biological active role and become the focus in the 21st century.Among them, accessing to a single, puring biological polysaccharide is the foundation of biological polysaccharide efficacy research.In this paper, summarizing to remove various impurity components of polysaccharides extracted polysaccharide technology based on literature research, provide certain technical support for the isolation and purification of polysaccharide.

Biological polysaccharide;Separation and purification;Research;review

R284

A