基于PCR方法对载体pBluescriptⅡSK(+)及pCAMBⅠA1300 的定点突变

蒲 艳，刘 超，林 琪，李继洋，刘晓东

(新疆农业大学 农学院，农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

基于PCR方法对载体pBluescriptⅡSK(+)及pCAMBⅠA1300 的定点突变

蒲 艳，刘 超，林 琪，李继洋，刘晓东

(新疆农业大学 农学院，农业生物技术重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

运用PCR定点突变技术对载体pBluescript Ⅱ SK(+)以及植物表达载体pCAMBⅠA1300多克隆位点内相关的酶切位点进行改造，为运用CRISPR/Cas9基因编辑载体在构建敲除体系时提供更多便捷可用的酶切位点。通过酶切鉴定以及测序表明，成功将pBluescript Ⅱ SK(+)载体多克隆位点内XhoⅠ、EcoR Ⅴ、SmaⅠ、SacⅡ 4个酶切位点，分别改造为NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ；将pCAMBⅠA1300植物表达载体多克隆位点内的SacⅠ、SalⅠ以2个酶切位点分别改造为NsiⅠ、PacⅠ，为今后构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体及对植物功能基因进行精准定位研究奠定一定的理论基础。

pBluescript Ⅱ SK(+)；pCAMBⅠA1300；定点突变；PCR

PCR介导的体外定点突变(Site-directed mutagenesis，SDM)技术是分子生物学研究领域中的一项非常重要的技术[1]，相比传统使用化学、物理等因素的诱导导致的突变效率更高并且操作简单，为基因修饰及改造提供了另一条途径。它可以根据需要，在体外对已知序列的特定位点通过插入、缺失或替换一定长度的核苷酸序列，实现精确的改变碱基序列。它是研究分子水平、蛋白质结构及功能之间联系的非常有力的一种手段[2]。现在包括PCR介导及非PCR介导的突变技术都有所改进[3-6]，目前熟为人知的方法有大引物PCR定点突变技术[7-9]、重叠延伸PCR定点突变技术[10-11]。由于上述方法仍存在某些因素，出现突变效率低的现象，因此PCR介导的定点突变法，仅需要一步聚合酶链式反应就能对全质粒进行扩增，产生点突变。因其操作简单、准确率高并且经济实惠，越来越受到人们的青睐。

CRISPR/Cas9基因编辑系统于2013年迅速崛起[12-13]，并已经高效运用于各种生物的基因定点编辑，受到了全世界的关注，目前，市面上虽然已有成套的CRISPR/Cas9基因组编辑试剂盒，提供完整的基因组编辑载体[14]，但考虑到物种特异性、基因序列的差异以及编辑载体在不同物种中的基因组编辑效率[15-16]，因此，一般常根据研究的自身需要，构建针对不同物种且能在该物种中高效精准地进行基因组编辑的编辑载体，由于在构建过程中需要使用到过渡载体pBluescript Ⅱ SK(+)以及植物表达载体pCAMBⅠA1300，需要考虑在编辑载体的各个元件中选择合适的限制性内切酶的酶切位点，然而在构建编辑载体时发现，该载体中由于Cas9序列大面积占有较多酶切位点，与原有pBluescript Ⅱ SK(+)和pCAMBⅠA1300载体多克隆位点存在冲突，所以在载体构建过程中选择酶切位点时比较局限。因此，本研究对上述2个载体多克隆位点部分酶切位点进行了改造，为今后构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用到的PCR模板pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300载体均由新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存，引物合成及测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300载体突变引物设计 通过设计1对互补的含预定突变位点的寡核苷酸引物，将突变碱基位于引物中央，两侧为18～19个正确的碱基，Tm值均为60 ℃。pBluescript Ⅱ SK(+)载体在多克隆位点4个酶切位点进行改造，分别设计3对引物进行3轮PCR扩增(表1)，首先设计1对引物在原始模板pBluescript Ⅱ SK(+)载体多克隆位点内将EcoR Ⅴ(GATATC)突变2个碱基为NheⅠ(GCTAGC)，SmaⅠ(CCCGGG)突变4个碱基为MfeⅠ(CAATTG)，第2对引物以第1轮测序正确后的质粒为模板分别将XhoⅠ(CTCGAG)突变4个碱基为NsiⅠ(ATGCAT)，第3对引物以第2轮测序正确的质粒为模板将SacⅡ(CCGCGG)主部碱基突变为PacⅠ(TTAATTAA)。

在植物表达载体pCAMB Ⅰ A1300设计1对引物进行1轮PCR，在其多克隆位点内的2个酶切位点进行改造将SacⅠ(GAGCTC)突变4个碱基为NsiⅠ(ATGCAT)，SalⅠ(GTCGAC)突变5个碱基为PacⅠ(TTAATTAA)。

1.2.2 突变反应 采用Phusion超保真DNA聚合酶进行扩增，扩增体系为：4 μL 5×phusion Buffer、1.6 μL 2 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物F和R各1 μL、1 μL DNA、0.2 μL Phusion高保真酶，补充ddH2O至20 μL。pBluescript Ⅱ SK(+)载体反应程序为94 ℃ 3 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 30 s，32个循环；72 ℃ 10 min。pCAMBⅠA1300载体进行克隆时扩增体系不变，反应程序仅改变延伸时间为7 min，反应程序结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，检测条带正确后用NEB公司的内切酶20 U/μLDPNⅠ进行消化原质粒模板的甲基化位点并转化大肠杆菌。候选阳性克隆再进一步进行酶切鉴定、测序。

表1 突变引物序列Tab.1 Sequence of mutant primers used for PCR amplification

注：下划部分为突变碱基序列。

Note：Underlined bases were designed mutant bases.

2 结果与分析

2.1 突变产物酶切鉴定

pBluescript Ⅱ SK(+)载体采用3轮PCR进行定点突变，每1轮对突变后的酶切位点进行单酶切检测，pBluescript Ⅱ SK(+)载体分3次改造了4个酶切位点分别用NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ进行单酶切鉴定观察结果(图1)，由于质粒有3种构型，故通过单酶切观察凝胶电泳图谱中只能看见线型质粒，说明初步构建成功，下一步进行测序。pBluescript Ⅱ SK(+)、pCAMBⅠA1300载体分别用通用引物M13、P1进行测序。若测序结果正确就进行下一步克隆，反应条件均不变。 第2步，以测序结果正确的质粒为模板进行克隆NsiⅠ及PacⅠ位点，提取质粒酶切鉴定送测序。植物表达载体pCAMB Ⅰ A1300采用1轮PCR,在其多克隆位点内的2个酶切位点进行改造，分别用NsiⅠ、PacⅠ进行酶切鉴定(图2)。

M.1 kb DNA 标准分子量；A.pBluescript Ⅱ SK(+)载体PCR扩增；B.1.pBluescript Ⅱ SK(+)为原质粒模板；2～4.pBluescript Ⅱ SK(+)突变后分别用Nsi Ⅰ、Nhe Ⅰ、Mfe Ⅰ、Pac Ⅰ酶切。M.1 kb DNA Marker；A.PCR amplification of pBluescript Ⅱ SK(+) vector；B.1.The original plasmid templet of pBluescript Ⅱ SK(+)；2-4.The mutationof pBluescript Ⅱ SK(+) use Nsi Ⅰ，Nhe Ⅰ，Mfe Ⅰ，Pac Ⅰ enzyme digestion respectively.

M.1 kb DNA 标准分子量；A.pCAMBⅠA1300载体PCR扩增；B.pCAMBⅠA1300突变后用 Nsi Ⅰ酶切；C：1.pCAMBⅠA1300原质粒模板；2.pCAMBⅠA1300突变后用Pac Ⅰ酶切。M.1 kb DNA Marker；A.PCR amplification of pCAMBⅠA1300 vector；B.The mutation of pCAMBⅠA1300 use Nsi Ⅰ enzyme digestion；C：1.The original plasmid templet of pCAMBⅠA1300；2.The mutation of pCAMBⅠA1300 use Pac Ⅰ enzyme digestion.

2.2 突变反应产物测序结果

pCAMBⅠA1300载体多克隆位点内突变的2个位点NsiⅠ、PacⅠ及pBluescript Ⅱ SK(+)载体突变后的4个位点NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ经测序结果分析其目标序列与设计序列完全一致(图3)。

3 讨论

体外突变技术是研究蛋白质结构及其功能之间复杂关系的有力工具，以及确认结构域或特定氨基酸所处位置的重要手段，是蛋白质组学研究的重点内容之一，也是实验室中用来改造及优化基因的常用手段。体外突变的方法较多，但传统方法一般以单链DNA作为模板，其操作繁琐、技术难度大并且实验成本较高，难以满足研究的要求。PCR介导的定点突变技术是以原始DNA为模板，设计突变引物进行PCR扩增。通过设计1对互补的突变引物，长度通常为30～35个核苷酸，错配碱基不宜过长一般位于引物5′端，引物两端互补的序列通常为18～19个核苷酸。其反应结果为2种产物：原始模板及扩增产物。DPNI酶可以有效地识别并切割原始质粒模板腺嘌呤甲基化的5′-Gm6ATC-3′序列[17]，而不能切断新合成模板中非甲基化的GATC序列，这样就避免了原始模版的干扰。进行20 U/μL DPNI酶消化质粒后，就可以将原质粒模板甲基化位点消除并变成许多被截断的DNA片段，而剩下没有被消化的质粒转化大肠杆菌后，该机体能够进行自我修复并由缺刻质粒变为环状质粒。试验中，采用60 ℃进行退火，高保真Phusion酶[18]，运用其3′到5′核酸外切酶活性降低错配率[19]。

下划部分表示酶切位点碱基序列，小写表示突变碱基。Bases underlined were restriction site，lower-case letters represent mutants bases.

方框1、2、3、4分别表示pBluescript Ⅱ SK(+)多克隆位点内突变后的酶切位点Nhe Ⅰ、Mfe Ⅰ、Nsi Ⅰ、Pac Ⅰ；5、6分别表示pCAMBⅠA1300多克隆位点内突变后的酶切位点Nsi Ⅰ、Pac Ⅰ。

pBluescript Ⅱ SK(+)载体是从噬菌体基因组中获得的一段序列改造而成，由于其序列中存在一段噬菌体侵染细菌并且在其体内能够稳定遗传的保守序列，因此可以在大肠杆菌中稳定复制。其次，也保证了该载体在大肠杆菌中以多拷贝形式存在，由于其在大肠杆菌中兼容性较高，因此被广泛应用于载体构建过程中，充当过渡载体。现在常用的 CRISPR/Cas9系统是基于细菌和古细菌获得的一种自身适应性免疫系统[20]， CRISPR/Cas系统分为：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ 3种不同类型，Cas9蛋白是Ⅱ型CRISPR/Cas系统的Cas相关蛋白(CRISPR associated protein，Cas),只分布在细菌中，是3个类型中较为简单的，其序列较大占有较多酶切位点，所以在载体构建过程中酶切位点的选择比较局限。因此本研究成功地改造了pBluescript Ⅱ SK(+)多克隆位点内XhoⅠ、EcoR Ⅴ、SmaⅠ、SacⅡ 4个酶切位点，并分别改造为NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ；pCAMBⅠA1300植物表达载体多克隆位点内的SacⅠ、SalⅠ 2个酶切位点，分别改造为NsiⅠ、PacⅠ，且改造位点在此载体中是唯一的酶切位点。为今后构建CRISPR/Cas9 基因组编辑载体系统，方便获得任何靶基因突变的植物材料，为进一步研究基因功能奠定了基础。该系统已经在动物、植物、微生物上取得了显著的成果，相信CRISPR/Cas系统在未来的基础理论研究、临床研究、基因治疗、作物育种、发酵工程等领域必将有越来越广阔的应用前景，并且有更深远的影响。

[1] Bu Y，Wang H，Li J，et al.Long distance multiple-site directed plasmid mutagenesis by one-step PCR using non-overlapped primers[J].Molecular Biotechnology，2013，55(1)：49-53.

[2] 张 浩，毛秉智.定点突变技术的研究进展[J].免疫学杂志，2000，16(S1)：108-110.

[3] Kunkel T A.Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1985，82(2)：488-492.

[4] Wei D，Li M，Zhang X，et al.An improvement of the site-directed mutagenesis method by combination of megaprimer，one-side PCR and DpnI treatment[J].Analytical Biochemistry，2004，331(2)：401-403.

[5] Nagy Z B，Felföldi F，Tamás L，et al.A one-tube，two-step polymerase chain reaction-based site-directed mutagenesis method with simple identification of the mutated product[J].Analytical Biochemistry，2004，324(2)：301-303.

[6] Chapnik N，Sherman H,Froy O，et al.A one-tube site-directed mutagenesis method using PCR and primer extension[J].Analytical Biochemistry，2007，372(2)：255-257.

[7] Angelaccio S，Bonaccorsi Di Patti M C.Site-directed mutagenesis by the megaprimer PCR method：variations on a theme for simultaneous introduction of multiple mutations[J].Analytical Biochemistry，2002，306(2)：346-349.

[8] Tseng W C，Lin J W，Wei T Y，et al.A novel megaprimed and ligase-free，PCR-based，site-directed mutagenesis method[J].Analytical Biochemistry，2008，375(2)：376-378.

[9] 张碧乾，邓会群，宫彩霞，等.大引物PCR定点突变方法的改进[J].湖北大学学报：自然科学版，2009，31(1)：79-81.

[10] Kumar R，Rajagopal K.Single-step overlap-primer-walk polymerase chain reaction for multiple mutagenesis without overlap extension[J].Analytical Biochemistry，2008，377(1)：105-107.

[11] 郭子平，翟清华，曾令锋，等.小麦 TaGAPC 定点突变体基因载体构建及其原核表达[J].华北农学报，2016，31(1)：46-50.

[12] Shan Q，Wang Y，Li J，et al.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system[J].Nature Protocols，2014，9(10)：2395-2410.

[13] Wang H Y，Yang H，Shivalila C S，et al.One-Step Generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-Mediated genome engineering[J].Cell，2013，153(4)：910-918.

[14] Feng Z，Zhang B，Ding W，et al.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].Cell Research，2013，23(10)：1229-1232.

[15] Jiang W，Zhou H，Bi H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification inArabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].Nucleic Acids Research，2013，41(20)：e188.

[16] Gao J，Wang G，Ma S，et al.CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis inNicotianatabacum[J].Plant Molecular Biology，2015，87(1/2)：99-110.

[17] Carey M F，Peterson C L，Smale S T.PCR-mediated site-directed mutagenesis[J].Cold Spring Harbor Protocols，2013(8)：738-742.

[18] Weiner M P，Costa G L.Rapid PCR site-directed mutagenesis[J].PCR Methods and Applications，1994，4(3)：131-136.

[19] Rabhi I，Guedel N，Chouk I，et al.A novel simple and rapid PCR-based site-directed mutagenesis method[J].Molecular Biotechnology，2004，26(1)：27-34.

[20] Li J F，Zhang D，Sheen J.Cas9-based genome editing inArabidopsisand tobacco[J].Methods in Enzymology，2014，546：459-472.

Site-directed Mutagenesis of pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 Vectors Based on PCR Method

PU Yan，LIU Chao，LIN Qi，LI Jiyang，LIU Xiaodong

(College of Agronomy，Xinjiang Agricultural University，Key Laboratory of Agricultural Biological Technology，Urumqi 830052，China)

In order to provide more convenient and efficient restriction enzyme site for the construction of CRISPR/Cas9 gene editing system in the future，the multiple clone site of pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 vectors were modified.DNA sequences showed that site-directed mutagenesis were successfully implemented in both pBluescript Ⅱ SK(+) and pCAMBⅠA1300 vectors.The four clone sites of pBluescript Ⅱ SK(+) aboutXhoⅠ，EcoR Ⅴ，SmaⅠ，SacⅡ were transformed toNheⅠ，MfeⅠ，NsiⅠ，PacⅠ respectely；Two clone sites of pCAMBⅠA1300，SacⅠ andSalⅠ were changed toNsiⅠ，PacⅠ.Thus，lay solid foundation for further use on CRISPR/Cas9 genome editing vector.

pBluescript Ⅱ SK(+)；pCAMBⅠA1300；Site-directed mutagenesis；PCR

2016-06-04

国家自然科学基金项目(31560534)

蒲 艳(1992-)，女，新疆乌鲁木齐人，在读硕士，主要从事植物分子生物学研究。

刘晓东(1975-)，男，新疆乌鲁木齐人，副教授，博士，主要从事作物分子设计育种研究。

Q78

A

1000-7091(2016)06-0083-05

10.7668/hbnxb.2016.06.013