固相萃取-高效液相色谱三重四级杆质谱联用法在北方河流水体氯霉素类抗生素测定中的应用

王勇，王钊

（1.漳河上游管理局水文水环境中心，河北邯郸056006；2.海河流域水资源保护局水环境监测中心，天津300170）

固相萃取-高效液相色谱三重四级杆质谱联用法在北方河流水体氯霉素类抗生素测定中的应用

王勇1，王钊2

（1.漳河上游管理局水文水环境中心，河北邯郸056006；2.海河流域水资源保护局水环境监测中心，天津300170）

建立了固相萃取-高效液相色谱三重四级杆质谱联用法，同时测定水中的4种氯霉素类抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺）残留，采用MRM扫描方式在正/负模式下，在10 min内完成对氯霉素类抗生素的分析，该方法线性范围为1～100μg/L，相关系数R2＞0.99，实际水样加标回收率为92.8%～117.48%。利用该方法对北方河流水样进行采样调查，其中氟苯尼考检出率较高为26%，达526.36 ng/L。该方法操作简便，灵敏度高，重现性好，具有一定的推广价值。

固相萃取；质谱；氯霉素；水质监测；北方河流

氯霉素类（CAPs）药物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，这类药物具有广谱抗菌能力，常用于预防与治疗动物疾病[1]，其中氯霉素曾在动物和人体上大量使用，但它会抑制人体骨髓造血功能从而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病[2]，已被禁止使用。欧盟、美国等均在食品法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”（Zero tolerance），即不得检出[3]。

甲砜霉素和氟苯尼考属于新型氯霉素类广谱抗菌药物，为氯霉素的替代药物，因其极佳的治疗效果正越来越广泛地被应用于治疗包括水产养殖在内的动物疾病。同时，其对动物有胚胎毒性，用药后还会出现厌食、腹泻等不良反应，对消费者的危害也逐渐被人们发现。目前，国内外检测该类药物残留的方法主要有微生物法、免疫分析方法和仪器分析方法、高效液相色谱法[4-6]，其中LC/MS成为确证氯霉素残留分析方法的发展趋势。

针对这些情况，建立了固相萃取-高效液相色谱三重四级杆质谱联用法以测定水中的4种氯霉素类抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺），优化了前处理条件和分离检测条件，并应用于实际水样的检测分析。该方法具有操作简单，试剂少，灵敏度高、定量准确，线性范围宽等优点。

1 试验材料和条件

1.1 材料

甲醇购自赛默飞世尔公司，色谱纯，纯度＞99.9%；乙腈购自J.T.baker公司，色谱纯，纯度＞99.9%；甲酸购自J.T.baker公司，色谱纯，纯度＞98.0%；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；标准储备液取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考标准品，用甲醇为溶剂，配置浓度为100 mg/L。

1.2 条件

（1）液相条件。柱温为35℃，流动相为乙腈和0.01%甲酸/水，流动梯度洗脱程序见表1。

表1 流动梯度洗脱程序

（2）质谱条件。离子源为电喷雾离子源（ESI），检测方式为多反应监测，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10 L/min。氯霉素类抗生素质谱分析的条件参数，见表2。

表2 氯霉素类抗生素的质谱参数

依次用10 mL甲醇和10 mL纯水，以3 mL/min流速活化HLB固相萃取小柱，取400 mL水样调节pH为3～4，以10 mL/L的流速上样，用6 mL甲醇分3次洗脱小柱，洗脱液在40℃由氮吹至近干，用乙腈/水（2∶8体积比）定容至1 mL，待测。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取方法优化

（1）固相萃取柱选择。C18为反相萃取柱，以十八烷基键合硅胶为填料，通过加标回收率试验发现，C18小柱对4种目标物质的回收率均较低，约为35%～55%。而Oasis HLB固相萃取小柱以N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯共聚物为填料，通过加标回收率试验发现，HLB小柱对4种目标物质的回收率均在90%以上，因此选用HLB小柱作为固相萃取柱。

（2）洗脱溶剂和体积选择。研究了4种甲醇∶水配比（分别为100∶0、90∶10、80∶20、70∶30）与4种洗脱体积（依次为2×2、3×2、4×2和5×2 mL）组合对目标物质的洗脱效果。其中，洗脱溶液为100%甲醇且体积为3×2 mL时洗脱效果最佳，各目标物质的回收率最高。

2.2 HPLC-MS/MS条件优化

氯霉素类化合物因含有酚羟基而适合在ESI源负离子模式下离子化，其产生的母离子为［M-H]－，代谢产物氟苯尼考胺则适合在ESI源正离子模式下离子化。

试验在干燥气氮气温度为350℃、流速为10L/min的条件下，在电喷雾正离子模式下，对100 μg/mL的氟苯尼考胺标准溶液进行母离子全扫描，确定其质子化分子离子[M+H]+；在电喷雾负离子模式下，再分别对100 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素标准溶液进行母离子全扫描，确定其质子化分子离子[M-H]－，然后以这些分子离子作为母离子对其子离子进行全扫描，最后选取丰度较强的两对离子，优化其锥孔电压、碰撞能量等质谱参数。

采用正离子模式进行质谱采集时，通常需在溶液中加入甲酸使分析物容易质子化而带上正电荷，但是使用甲酸后甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的负离子模式采集会受到抑制。本试验发现，以乙腈和水作为流动相，各组分均能得到较好的分离，在质谱上均有较强的响应，并且峰形好看，与已有报道现象相同[7，8]。

2.3 标准曲线绘制

以乙腈/水（2∶8体积比）逐级（0.1、1、10、50、75、100 μg/L）稀释的标准工作液，在试验条件下进样（10 μL），结果经线性回归，以峰面积（y）为纵坐标、标准液浓度（x）为横坐标绘图，获得氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的线性方程。4种氯霉素类抗生素的线性范围、回归方程、相关系数及回收率，见表3。

表34种氯霉素类抗生素的线性范围、回归方程、相关系数及回收率

2.4 实际水样分析

采用SPE-HPLC/MS/MS方法对北方河流150个站点河水进行了采样调查，实际水体加标回收率为92.8%～117.48%。试验结果显示，河水中氟苯尼考检出率最高为26%，浓度为0～526.36 ng/L。

氟苯尼考被应用于治疗包括水产养殖在内的动物疾病。检出浓度较高的地点，附近可能有养殖场的存在，由于下雨冲刷随地表径流进入河道。从季节来看，8和11月检出率较高，可能由于养殖场的管理不善和正值投药时间。

3 结语

氯霉素类抗生素的监测多为高效液相色谱检测。在试验过程中，发现高效液相色谱只是依靠保留时间定性，对于多种物质的检测需要通过对各个标准物质保留时间分离；对于复杂的水样来说，其有可能出现重叠峰，进而会影响定量。而高效液相色谱三重四级杆质谱联用法，是通过物质的母离子和子离子来定性，每种物质都有特定的组合，能更好地适应复杂的水样定量监测。

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1004-7328（2016）06-0065-03

10.3969/j.issn.1004-7328.2016.06.021

2016—07—21

王勇（1966—），男，高级工程师，主要从事水文水资源管理、水质监测工作。