不同天然保鲜液对气调包装冰温贮藏鲶鱼片品质的影响

2017-01-17朱迎春马俪珍党晓燕

农业工程学报 2017年1期

朱迎春，马俪珍，党晓燕，王洋

（1. 山西农业大学食品科学与工程学院，太谷 030801；2. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384；3. 天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

朱迎春1，马俪珍2※，党晓燕1，王洋3

为延长鲶鱼片货架期，提高其食用安全性，该试验将新鲜鲶鱼片分别用3种天然保鲜液以及无菌蒸馏水（对照组）处理后，气调包装（60% CO2+40% N2），贮藏于–0.7 ℃的冰温库中，考察3种天然保鲜液对鲶鱼片感官品质、微生物指标、常规理化指标以及鱼肉蛋白氧化程度的影响。结果表明：1#保鲜液（由壳聚糖、蜂胶、溶菌酶和茶多酚等复配而成）与3#保鲜液（纯乳酸菌发酵液）降低了鲶鱼片中的菌落总数、pH值、总挥发性盐基氮（total volatile base-nitrogen，TVB-N）值和K值的上升；2#保鲜液（桂皮、丁香、生姜和大蒜）具有极好的抗氧化功能，使硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid resctive subastances，TBARS）值在整个贮藏期间维持在较低（0.09～0.14 mg/kg）水平；3种天然保鲜液均不同程度延缓了鲶鱼肉肌原纤维蛋白的氧化，抑制了羰基含量的增加和总巯基含量的减少。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）结果显示，经3种保鲜液处理，鲶鱼片肌原纤维蛋白发生交联聚合和小片化的程度降低。由此可见3种保鲜液在不同程度上均可抑制鲶鱼片微生物生长、蛋白降解、脂肪和蛋白氧化，较好地保持鲶鱼肉的新鲜度，延缓腐败变质的发生，3组保鲜效果排序为3#＞1#＞2#，1#，2#，3#保鲜液组货架期分别达到40、30和40 d，而无菌蒸馏水处理组为20 d。研究结果为天然保鲜液在鲶鱼肉贮藏中的应用提供参考。

贮藏；包装；品质控制；鲶鱼片；天然保鲜液；蛋白氧化

0 引言

革胡子鲶鱼（Clarias gariepinus）肉质细嫩，无肌间刺，蛋白质、脂肪和矿物质含量丰富，对人体健康具有很好的补益作用。但宰杀后的鲶鱼肉极易腐败变质，因此寻找行之有效的保鲜措施已成为目前研究的重要课题之一。天然保鲜剂从动植物中提取，具有无毒、安全、成本低的特点。近些年来，利用天然保鲜剂来提高肉与肉制品品质的研究引起了国内外学者的关注。Mitsumoto[1]研究显示在冷藏的牛肉饼和鸡肉饼中，茶多酚的抗氧化效果要好于维生素C。Mansour等[2]发现添加了生姜和胡芦巴籽提取物的牛肉饼能有效控制脂肪的氧化并改善肉饼的色泽。Maqsood等[3]将凯恩木提取物应用于亚洲鲈鱼糜中，发现0.1%凯恩木提取物可以作为一种天然抗氧化剂抑制鱼糜的氧化。土豆皮的乙醇提取物应用于冷藏的金枪鱼中可以有效延缓脂肪和肌原纤维蛋白的氧化，抑制过氧化值和羰基含量的增加[4]。国内利用纳他霉素、乳酸链球菌素、香辛料提取液、壳聚糖等处理海参、鲫鱼和鸭肉等，获得了明显的效果，能较好地维持肉的品质并延长其保质期[5-7]，本课题组前期筛选出的3种天然保鲜液应用于冷却猪肉已经证实保鲜效果良好[8-9]，但是如何将天然保鲜液应用于鲶鱼肉从而提高其安全品质，目前尚未见报道。

冰温贮藏是一种将生鲜食品置于 0℃以下到其冻结点以上的温度范围内进行贮藏的技术，既可防止食品中冰晶的形成，避免食品组织结构受到损伤，又能很好地抑制微生物生长，延缓生理生化反应速率[10-11]。对水产品进行气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）已经证明能极大程度地抑制腐败菌的生长并延长货架期。经过速冷处理在–2 ℃下MAP贮藏的大西洋鲑鱼片(Salmo salar) 24 d之内质量保持良好[12]；生鲜脆肉鲩鱼片(Ctenopharyngodon idellus)臭氧充气包装和CO2充气包装保鲜效果优于真空包装[13]。气调包装（45% CO2,50% N2,5% O2）鬼头刀鱼(Coryphaena hippurus)降低了脂质氧化的程度[14]；与空气包装比较，3种气调包装（60% CO2+40%N2,70% CO2+30% N2和80% CO2+20% N2）的海鲤(Sparus aurata)鱼片都对副溶血性弧菌和嗜水气单胞菌有很好的抑制作用[15]。

通过前期试验，本研究已经获知鲶鱼片进行MAP（60% CO2+40% N2）后冰温（–0.7 ℃）贮藏，比常规的空气包装（air-package,AP）低温贮藏（4 ℃）更有利于维持鲶鱼片的食用及理化品质[10]。为了进一步延长鲶鱼片的货架期，提高其食用安全性，课题组采用天然保鲜液处理鲶鱼肉片，再结合MAP（60% CO2+40% N2）包装、冰温贮藏（–0.7℃），通过测定贮藏过程中的感官品质、微生物、理化指标和蛋白氧化变化，了解3种方式的协同增效作用对鲶鱼片的保鲜效果，为综合保鲜技术的开发和在水产品加工中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20条鲜活革胡子鲶鱼（Clarias gariepinus），平均每条质量（1 250±50）g，体长（30±2）cm，从天津红旗农贸市场购买后，30 min内运至天津农学院食品加工车间。

主要试剂：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、tris-HCl、乙醚、石油醚、硼酸、氯仿、乙酸乙酯、氧化镁、盐酸胍、甲醛、5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、硫酸铜、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、β-巯基乙醇、N-乙基马来酰亚胺、过硫酸铵、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、尿素、考马斯亮蓝G-250、十二烷基磺酸钠、牛血清白蛋白等，以上均为分析纯。茶多酚，购于河南亿特化工产品有限公司；壳聚糖，购于上海康朗生物技术有限公司；乳酸链球菌素、溶菌酶，购于山东丰泰生物技术有限公司；ATP（adenosine triphosphate）、ADP（adenosine diphospahte）、AMP（adenosine monophos phate）、IMP（inosine monophosphate）、Inosine、HX（hypoxanthine）标品购于美国sigma公司；类植物乳杆菌由中国农业大学食品科学与营养工程学院微生物实验室提供。

1.2 仪器与设备

pH计（PB-10，瑞典Sartorius公司）；紫外可见分光光度计（UV-180，日本岛津公司）；全自动雪花制冰机（IMS-50，河南兄弟仪器设备有限公司）；冷冻离心机（ST-40R，德国Thermo-fisher公司）；内切式匀浆机（18 Basic，德国IKAT公司）；半微量凯式定氮仪（UDK159，意大利VELP公司）；气调包装机（MP-H2，韩国HYPERPAC公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1200 unit，美国安捷伦公司）；垂直电泳仪（DYY-6C，美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（GelDoc XR+，美国Bio-Rad 公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 天然保鲜液的组成及制备

1#保鲜剂的配制：壳聚糖5 g溶解于10 mL质量分数2%乙酸溶液，蜂胶1 g溶解于10 mL质量分数30%乙醇溶液，Nisin 0.75 g，溶菌酶0.75 g，茶多酚5 g，将上述物质加入到1 000 mL容量瓶中，用无菌蒸馏水定容。1#保鲜剂组成为壳聚糖0.5%、蜂胶0.1 %、Nisin 0.075%、溶菌酶0.075 %、茶多酚0.5%。

2#保鲜剂的配制：分别将丁香和桂皮在高速粉碎机中粉碎成粉末，称取丁香粉和桂皮粉各6.0 g和5.6 g，分别加入94 g 31.8%乙醇和94.4 g蒸馏水中，70 ℃恒温水浴6和7 h，期间不断振摇，冷却，然后2 000×g离心15 min取上清液即得到含有效成分6%丁香液和5.6%桂皮液。生姜和大蒜去皮、榨汁，2 000×g离心15 min，取上清液冷藏备用。分别取丁香乙醇浸提液27.65 mL、桂皮水提液40.39 mL、生姜上清液19.12 mL、大蒜上清液12.84 mL制成体积为100 mL的香辛料保鲜液。2#保鲜液组成为：桂皮5.6%、丁香6 %、生姜19.12%和大蒜12.84%。

3#保鲜液：纯乳酸菌发酵液。制备方法是将具有产生细菌素能力的类植物乳杆菌（Lactobacillus paraplantarum,L-ZB1）用MRS液体培养基传代培养3～4代，当活菌总数达2.7×109cfu/mL时直接用作保鲜液。

1.3.2 贮藏试验

将以鲜活方式运输到食品加工车间的20条革胡子鲶鱼（Clarias gariepinus）放入5～7 ℃冰水中10 min使其致晕，立即宰杀，去头、去皮、去内脏、去骨剖片后，用无菌冰水洗涤，沥干水分，切成4 cm×3 cm×1 cm鱼片，每片质量为（20±2）g，共670片。将所切鱼片充分混合，取出其中的10片鱼肉用于初始点各项指标的测定，其余的平均分成4组，每组165片，分别添加5%（按肉的质量）的1#、2#、3#保鲜液和无菌蒸馏水（作为对照，CK组）并搅拌均匀，然后进行MAP（60% CO2+40% N2），置于（-0.7±0.02）℃冰温库（国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津）贮藏。分别在贮藏第4、10、15、20、30、40、50和60天进行感官评定、pH值、总挥发性盐基氮（total volatile base-nitrogen,TVB-N）、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid resctive subastances,TBARS)、K值及蛋白氧化指标（羰基含量、总巯基含量）和蛋白交联聚合和小片化程度（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的测定，以评定各组样品的品质变化及不同保鲜液对鲶鱼片品质的影响。

1.3.3 指标测定方法

1）感官评定

感官评定由10名专业人员组成的感官评定小组进行，针对生鱼片的气味、色泽、组织状态、弹性，熟鱼片的气味、滋味、汤汁形态7个方面分别评分。每项指标分5个等级（新鲜、较新鲜、一般、腐败及严重腐败），满分为10分，6分以下视为不合格，总分值为70分，低于42分视为产品不可食用。具体评分标准见表1。

2）菌落总数的测定：按GB /T 4789. 2-2010规定的方法进行。

3）pH值的测定：按GB /T 9695.5- 2008规定的方法进行。

4）挥发性盐基氮的测定：参照GB/T 5009.44-2003 规定，采用半微量凯式定氮法进行。

5）脂肪氧化值测定：TBARS值的测定参考 L iza[16]的方法。

6）K值（ATP关联物）的测定：参照Zhu[17]的方法，采用高效液相色谱仪进行分析。

当地主要的种植作物为玉米。今年原平市田园丰化肥经销部的肥料销售情况对比去年来说基本持平。农民的用肥积极性一般，主要原因是农产品卖不上价格，农民收入不高，导致农民化肥需求下降。当地赊销情况比较严重，但目前来看，回款情况还不错。田园丰化肥经销部销售的化肥主要以传统大肥为主，在新型肥料方面涉及较少。

表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard

式中ATP为三磷酸腺苷；ADP为二磷酸腺苷；AMP为一磷酸腺苷；IMP为次黄苷酸；Hx为次黄嘌呤；INO为肌酐；单位均为μmol/g。

7）蛋白羰基的测定：参照Oliver[18]的方法，采用2,4-二硝基苯肼方法。

8）蛋白总巯基含量测定：参考Ellman[19]的方法。

9）SDS-PAGE：参考Laemml[19]的方法。吸取前处理后的上清液20 μL进行点样，浓缩胶质量分数为4%，分离胶质量分数为12%。样品在浓缩胶中电流为20 mA，进入分离胶后电流改为40 mA。

1.4 数据统计与分析

试验均重复3次，结果用平均值±标准偏差表示。数据统计分析采用Statistix 8.1软件包（St Paul,MN）中线性模型（Linear Model’s）程序进行方差分析，采用Tukey HSD程序进行差异显著性分析（P <0.05），采用SigmaPlot 10.0绘图软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同保鲜剂对MAP冰温贮藏鲶鱼片感官品质的影响

鱼体及鱼类产品在贮藏过程中的可接受性依赖于它的感官变化，随着贮藏时间的延长，在自身内源酶及外来微生物的作用下，鲶鱼体内的蛋白质、氨基酸和其他含氮物质会被分解成为氨、三甲胺、硫化氢及吲哚等低级产[20]，产生具有腐败特征的臭味而失去食用价值。不同保鲜液对MAP鲶鱼片感官品质的影响如图1所示。贮藏前期（0～10 d），4组鲶鱼片均很好地保持了新鲜品质（感官评分值>56），而且不同处理组之间没有显著性差异（P>0.05）。随着贮藏时间的延长，鲶鱼片进入次新鲜阶段（二级鲜度）。CK组保持二级鲜度的时间较短，贮藏30 d时鲶鱼片色泽暗淡，汤汁浑浊，有轻微的腥臭味和氨臭味出现，不再适于食用而进入到腐败阶段（感官分数<42）。而1#处理组和3#处理组在冰温贮藏40 d时仍维持在二级鲜度，50 d之后才进入腐败阶段。2#处理组在品质保持上不及1#处理组和3#处理组，贮藏40 d进入腐败阶段，但在贮藏30 d时感官得分显著高于CK组（P<0.05）。通过感官评定可知CK组、1#处理组、2#处理组和3#处理组鲶鱼片分别在20、40、30和40 d达到感官可接受期限的极限点。

图1 不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程感官品质评价Fig.1 Sensory evaluation of channel catfish fillets during super-chilling storage with different treatments

2.2 不同保鲜剂对MAP冰温贮藏鲶鱼片菌落总数的影响

图2 不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程中菌落总数的变化Fig.2 Changes in total viable counts of channel catfish fillets during super-chilling storage with different treatments

2.3 不同保鲜剂对MAP冰温贮藏鲶鱼片理化性质的影响

2.3.1 pH值的变化

pH值是检测鲶鱼肉新鲜与否的重要指标。不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程pH值的变化如图3a所示。由图3a可以看出，鲶鱼片初始pH值约为6.85，不同处理组在贮藏前期（0～10 d）pH值变化不显著（P>0.05）。贮藏后期（10～60 d），糖原被消耗殆尽，蛋白质和其他含氮物质分解产生氨及其他碱性物质，使CK组pH值略有上升（40 d达到7.02），但其他3个处理组仍维持在较低水平（5.74～6.61）。这是因为1#保鲜液中的壳聚糖由2%醋酸溶液配制而成，具有较低的pH值；2#保鲜液的加入抑制了鲶鱼肉中酶和微生物的活性，减少了碱性物质的生成；3#保鲜液是具有高度活性的乳酸菌液，乳酸菌液呈酸性，且乳酸菌具有活性，在贮藏过程中还会生长繁殖，导致贮藏过程中pH值呈下降趋势。

2.3.2 TVB-N值的变化

TVB-N 值是评价水产品鲜度的常用指标，它反映水产品蛋白质因内源性酶或微生物作用分解而产生的挥发性氨和胺类化合物的程度[17]。不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程TVB-N值的变化如图3b所示。由图3b可知，4组鲶鱼肉片的TVB-N值总体均呈现上升的趋势。1#处理组、2#处理组和3#处理组在贮藏前期（0～20 d）TVB-N值缓慢上升，20 d达到6.90～7.37 mg/100 g且3组之间差异不显著（P>0.05），20 d后TVB-N值快速上升，40 d分别达到16.71 mg/100 g（1#处理组），19.41 mg/100 g（2#处理组）和17.08 mg/100 g（3#处理组），均低于国标规定的20 mg/100 g的临界值。CK组在贮藏过程中TVB-N值与处理组相比差异显著（P<0.05），40 d时达到22.59 mg/ 100 g，超过国标规定的20 mg/100 g的临界值，而1#处理组、2#处理组和3#处理组鲶鱼片分别在贮藏60、50和60 d时达到20.53 mg/100 g，22.12 mg/100 g和21.46 mg/ 100 g，超过20 mg/100 g的临界值。试验说明3种保鲜液的添加均起到了减缓TVB-N值变化的作用。

图3 不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程理化指标的变化Fig.3 Changes in physical and chemical indexs of channel catfish fillets during super-chilling storage with different treatments

2.3.3 TBARS值的变化

TBARS值常作为判定脂质过氧化程度的指标[21-22]。不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程TBARS值的变化如图3c所示。由图3c可知，0～7 d，各组TBARS值均缓慢增长且无显著差异（P>0.05）。在10～60 d的贮藏过程中，除2#处理组外，其他组TBARS值均随着贮藏时间的延长而显著上升（P<0.05）。CK组TBARS值从0.22 mg /kg（10 d）上升到0.61 mg kg（40 d）（P<0.05）。3#处理组与CK组变化趋势一致且两组之间差异不显著（P>0.05），说明乳酸菌液的添加没有很好地抑制脂肪的氧化。1#处理组TBARS值上升速率低于CK组和3#处理组且差异显著（P<0.05），说明1#保鲜液的添加可明显抑制脂肪氧化。整个贮藏期内2#处理组TBARS值较为平稳，基本维持在0.09～0.14 mg /kg，可见2#保鲜液对控制鱼肉中脂肪氧化的效果最好。

2.3.4 K值的变化

K值是以分析鱼体中ATP及其降解产物的含量为基础，通过进一步计算得到的指标，它能够反映水产品在贮藏过程中新鲜度的变化情况。不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程K值的变化如图3d所示，由图3d可知，在冰温贮藏期间鲶鱼片CK组、1#处理组、2#处理组、3#处理组的K值分别从最初的3.10%上升至贮藏末期的71.70%（40 d）、66.36%（60 d）、89.90%（60 d）和61.28%（60 d）。一些对鱼新鲜度要求较严的国家认为K值20%以下为一级鲜度，20%～40%为二级新鲜度，60%～80%为初级腐败。根据这个分类方法，贮藏前10 d，4组都为一新鲜度。贮藏第15天，CK组和 2 #处理组的 K 值为 2 2.69%和24.76%，超过一级鲜度，而1#处理组和3#处理组仍为一级鲜度。贮藏第25天，CK组和2#处理组己明显超过二级鲜度，而1#和3#处理组K值仍低于40%。K值增加是由于内源性酶的作用，也受细菌活性的影响。1#和 3 #处理组K值较低的原因在于1#保鲜液和3#保鲜剂能明显抑制细菌繁殖，使鱼肉中的5-核苷酸酶的活性受到抑制[17]，减少AMP的降解，从而使K值明显低于对照组（P<0.05）。

2.4 不同保鲜剂对鲶鱼片肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins，MP）性质的影响

2.4.1 MP中羰基含量的变化

蛋白在贮藏过程中，容易被周围环境氧化而形成含羰基的化合物。这是因为蛋白质在脂肪氧合酶、过氧化物酶和微生物酶的作用下发生了酶促反应[23]，将含有NH-或NH2-侧链的蛋白质氧化并将NH-或NH2-转化为羰基，导致羰基含量的增加[24]。不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程羰基含量的变化见图4a。由图4a可以看出，所有处理组羰基含量均随贮藏时间的延长而增加。加入不同保鲜液在贮藏后期可抑制羰基的形成，其中以2#保鲜剂的抑制效果最为明显，贮藏40 d时其羰基含量为2.73 nmol/mg，显著低于CK组（4.95 nmol/mg）（P<0.05）。Gardner等[25]报道脂肪氧化所生成的二级产物、氢过氧化物和游离基都可以和蛋白发生氧化反应形成羰基化合物，进而导致鱼和鱼产品的品质下降直至不能食用。Eymard等[26]研究表明蛋白氧化和脂肪氧化具有相同的催化剂，脂肪氧化可以促进蛋白的氧化。本试验中 2 #保鲜液含有抗氧化物质如姜辣素、姜酮、姜油醇、姜酚及柠檬醛等，可以保护蛋白免受过氧化物的攻击进而减少羰基化合物的生成。贮藏40 d后1#处理组羰基含量与2#处理组差异不显著（P>0.05），但 3 #处理组羰基含量显著高于其他两组（P<0.05)，达到7.04 nmol/mg（50 d）和7.49 nmol/mg（60 d）。

2.4.2 MP中总巯基含量的变化

不同保鲜液对MP总巯基含量的影响如图4b所示，由图4b可知，随着贮藏时间的延长，不同处理组的总巯基含量均呈下降趋势。新鲜鲶鱼片 M P中的总巯基含量为115.51 nmol/mg，贮藏至40 d，CK、1#处理组、2#处理组和3#处理组的总巯基含量分别降低到54.53 nmol/mg、64.23 nmol/mg、81.15 nmol/mg和55.38 nmol/mg，其中CK组含量最低而2#处理组含量最高并且二者差异显著（P<0.05）。巯基（SH）是蛋白分子中非常重要的功能基团，巯基含量的减少可能是巯基之间形成了二硫键或是巯基与低分子量的水溶性蛋白分子片段发生了交联作用[27]。熊幼翎[28]则推测巯基含量的减少除了二硫键的形成导致蛋白发生降解或聚合外，也可能是由于半胱氨酸的氧化而导致的。半胱氨酸位于肌球蛋白头部的酶促反应中心，往往最易于遭受氧自由基的攻击而被氧化。结合图4a羰基含量的变化，2#处理组较好地抑制了总巯基含量的降低和羰基含量的升高，说明 2 #处理组很好地抑制了MP的氧化。

图4 不同处理的鲶鱼片冰温贮藏过程蛋白氧化指标的变化Fig.4 Change of myofibrillar protein oxidation of channel catfish fillets during super-chilling storage with different treatments

2.4.3 冰温贮藏过程中SDS-PAGE图谱的变化

图5是鲶鱼片MP的SDS-PAGE的降解模式，MP主要包括肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、副肌球蛋白（paramyosin）、肌动蛋白（actin）、原肌球蛋白（tropomyosin）和肌钙蛋白（troponin）。SDS-PAGE电泳图谱中高分子质量条带的扩展、模糊、弱化、消失及低分子质量条带的出现及浓度加强是蛋白质分子不断降解的外在表现。贮藏初始阶段，MP各条带明亮清楚，随着贮藏时间的延长，CK组MHC和Paramyosin随着贮藏时间的延长淡化明显，是高分子量的蛋白条带发生了降解或聚合的结果[29]，Actin、Tropomysin蛋白条带逐渐弱化及Troponin条带弱化并消失，说明贮藏时这部分蛋白发生了降解，这一结果与TVB-N值及K值的结果（图3b和图3d）相一致。Roura等[30]对冰藏磨鱼的MP进行电泳分析，在电泳图谱上发现大分子量条带变淡，并有新的小分子量条带出现，表明在冻藏过程中出现了交联反应而沉积或出现新的蛋白质肽链。

图5 冰温贮藏过程鲶鱼片肌原纤维蛋白SDS-PAGE图谱Fig.5 SDS-PAGE pattern of channel catfish fillet myofibrillar proteins during super-chilling storage

而添加不同的保鲜液使MP的条带与CK组相比有所差异。贮藏过程中1#处理组、2#处理组和3#处理组条带变化不是很明显，MHC、Actin和Tropomysin条带的浓度和亮度随贮藏时间的变化不大，只有在贮藏终点（60 d）时，才可较为清晰的看到这三条条带变细，说明保鲜液对蛋白具有保护作用，可以延缓MP的降解。原因可能为天然保鲜液中的某些成分通过离子键或氢键与蛋白质分子结合或聚集在其周围，MP分子被这些保鲜液所包裹，阻止了蛋白变性的发生。Zhou[31]也报道加入海藻糖的罗非鱼糜比空白对照生成更少的交联键从而延缓MP的降解。

3 讨论

天然防腐剂无毒无害，绿色安全，而且还显示出较强的抗菌和抗氧化功能[1-7]。1#保鲜液由茶多酚、壳聚糖、溶菌酶、Nisin、蜂胶按比例配合而成。Nisin和溶菌酶对革兰氏阳性菌作用强；蜂胶对革兰氏阴性菌作用强；茶多酚既有抑菌作用又有抗氧化作用；壳聚糖则对肠杆菌、沙门氏菌及葡萄球菌等多种微生物都有较强的抑制作用[32]，研究报道壳聚糖还可以有效抑制三甲胺生成和脂肪氧化，降低生物胺生成量，使尸胺被完全抑制，组胺质量分数小于50 mg/kg[33]。几种防腐剂按一定比例配合，可表现出协同增效作用。李静雪[34]在鲤鱼鱼肉中加入0.97%壳聚糖＋0.43%溶菌酶＋0.48%维生素C进行冰温（-1 ℃）保鲜，使鲤鱼肉的保鲜期达到20 d。本研究1#处理组在贮藏40 d时TVC小于6.00 log（cfu/g）（CK组TVC已大于7.00 log（cfu/g）），仍在食用安全范围之内，获得比上述研究更好的效果。

本试验中 2 #保鲜液主要由香辛料按比例配制而成，大蒜中的蒜辣素和蒜氨酸，生姜中的姜辣素、姜酮、姜油醇、姜酚及柠檬醛等，对多种微生物均有强烈的抑制作用和抗氧化作用[35-36]。本研究结果表明2#保鲜液的抗氧化性能好，所用香辛料中的姜酮、姜油醇等化合物含有酚羟基，可提供活性质子，当油脂氧化产生过氧化物自由基时，酚羟基上的供氢体能将其捕获，使连锁反应中断或延缓，阻止了氧化反应的发生，达到抗氧化目的[37]。Kanatt等利用薄荷精油用于羊肉冻藏保鲜时发现，薄荷精油中也含有酚羟基类化合物，也可有效地减缓脂质氧化[38]。

3#保鲜液除了利用自身的乳酸菌成为优势菌群的特性抑制其他腐败菌的生长之外，乳酸菌在生长繁殖过程中所产生的细菌素（如乳酸链球菌素nisin、乳杆菌素lactocidin、嗜酸菌素acidophilin，酸菌素 a cidolin）也起着非常重要的作用[39]。Schoeman认为与食品中直接添加纯化的或半纯化的细菌素制剂相比，加入产细菌素的乳酸菌进行保鲜更可取，这样更有利于细菌素在食品中的均匀分布和维持细菌素的活性，进而有利于食品的防腐保鲜[40]。

从组织结构而言，由于构成肌肉蛋白的主要成分是肌原纤维蛋白，所以水产品品质的变化是由它在结构上的变化导致的。肌原纤维蛋白高级结构的破坏、内部疏水口袋的展开、肽键与蛋白酶的结合以及自由基引发的蛋白质变性都会导致氧化的发生[41]，使酶活性和蛋白溶解度下降，形成蛋白聚合物并产生非酶褐变[42]。Rowe[43]研究表明，蛋白氧化的过程通常会导致肌肉蛋白功能特性下降、失水率增加、凝胶性和乳化稳定性减弱。此外，这些变化对肉和肉制品的感官品质，如质构、嫩度和色泽也会产生负面影响。Lund[44]等研究结果表明，蛋白被氧化易发生交联，肉的嫩度和多汁性下降。为了提高水产品质量，必须要适当控制蛋白氧化。这需要通过改变贮藏温度和控制贮藏过程中的气体环境来提高原料肉的功能特性。经前期测定，鲶鱼肉的冰点为-0.8 ℃，将鲶鱼片贮藏在-0.7 ℃的冰温库中（冰温库温度波动控制在±0.02 ℃），既可避免形成冰晶而引起肌原纤维蛋白的不可逆变性，同时又保证鲶鱼片尽可能贮藏于较低的冷藏温度下。气调包装中含有60%CO2，CO2既易溶于水形成碳酸从而抑制微生物的繁殖，同时，一定浓度的 C O2也能阻止细菌细胞的正常代谢。加上天然保鲜液的协同作用，减缓了鲶鱼肉肌原纤维蛋白氧化的速率，维持了鲶鱼肉片良好的食用品质。

活鱼的保鲜保活仍然存在着经济和技术上的难题。鲶鱼宰杀后得到鲶鱼片，将其进行保鲜液处理、气调包装、冰温贮藏等综合保鲜，具有占地面积小、能源消耗低、新鲜度好的优点，同时也省去了消费者购买活鱼后还需宰杀的麻烦，为食用带来极大便利。通过试验可知2#保鲜液抗氧化性能好，但抑菌性稍差，如能与其他两种保鲜液复配，将获得抑菌和抗氧化的双重效果。同时，2#保鲜液由香辛料的提取物制成，产品带有五香风味，如能在现有配方基础上加盐等调味品，则成为一种调理肉制品，消费者购买后经过简单的煎炸即可食用，具有方便快捷的特点。

根据各种保鲜液的配比和各辅料的市场价格，计算出每千克保鲜液的原料成本，即配制1 kg 1#、2#和3#保鲜液，其原料成本价格依次为 1 9.22元、2.46元和 9 .03元。按照鲶鱼片需要加入质量分数为5%保鲜液，处理100 kg鲶鱼片所增加的保鲜液成本分别是96.1元、12.3元和45.0元，可以看出 3 种保鲜液成本较为低廉，且所增加的成本比起它所起的保鲜作用来说性价比很高。1#保鲜液贮存稳定性好，可以作为商品来生产；2#保鲜液成本最低，不失为一种可以实际应用的天然保鲜液；3#保鲜液必需现用现配，但因为它利用乳酸球菌的竞争性作用来达到抑菌目的，既安全效果又好，可根据实际情况加以选择应用。因此以上3种保鲜液均可用于工业化生产。

4 结论

通过研究 3种不同天然保鲜液对气调包装（60% CO2+40% N2）鲶鱼片冰温贮藏过程中品质的影响，可得出以下结论：1#保鲜液（由壳聚糖、蜂胶、溶菌酶和茶多酚等复配而成）、2#保鲜液（由桂皮、丁香、生姜和大蒜复配而成）和 3 #保鲜液（纯乳酸菌发酵液）3种保鲜液均能较好的延缓感官品质变化，抑制微生物生长、蛋白分解和脂肪氧化，延缓鲶鱼肌原纤维蛋白的氧化及降解。1#保鲜液和3#保鲜液能显著抑制菌落总数、pH值、总挥发性盐基氮值和K值的上升，2#保鲜液具有极好的抗氧化功能，在整个贮藏期间显著抑制了肌原纤维蛋白羰基值的上升和总巯基含量的下降，并使硫代巴比妥酸值维持在0.09～0.14 mg/kg。通过理化指标、微生物指标及感官品质的综合评价，1#处理组、2#处理组与 3 #处理组的货架期分别为40、30和40 d（CK组为20 d）。综合来看，1#保鲜液保鲜性能好，易贮藏，2#保鲜液抗氧化性强，成本低廉；3#保鲜液利用外源益生菌来抗菌防腐，均具有良好的保鲜效果，企业可根据不同的条件和要求加以选择。

[1] Mitsumoto M O,Grady M N,Kerry J P,et al. Addition of tea catechins and vitamin C on sensory evaluation,colour and lipid stability during chilled storage in cooked or raw beef and chicken patties[J]. Meat Science,2005,69(4):773－779.

[2] Mansour E H,Khalil A H. Evaluation of antioxidant activity of some plant extracts and their application to ground beef patties[J]. Food Chemistry,2000,69(2):135－141.

[3] Maqsood S,Benjakul S. Effect of kiam(Cotylelobium lanceolatum Craib) wood extract on the haemoglobinmediated lipid oxidation of washed Asian sea bass mince[J]. Food and Bioprocess Technology,2013,6(1):1－12.

[4] Farvin K H S,Grejsen H D,Jacobsen C. Potato peel extract as a natural antioxidant in chilled storage of minced horse mackerel(Trachurus trachurus):effect on lipid and protein oxidation[J]. Food Chemistry,2012,131(3):843－851.

[5] 朱璐璐，农绍庄，李江阔，等. 两种生物保鲜液对鲜活海参贮藏品质的影响[J]. 食品工业，2015，37(6)：128－132 Zhu Lulu,Nong Shaozhuang,Li Jiangkuo,et al. Effect of two kinds of biological preservation solution on the storage quality of fresh sea cucumber [J]. The Food Industry,2015,37(6):128－132(in Chinese with English abstract)

[6] 赵文红，白卫东，朱佳蕾，等. 复配保鲜剂对冰鲜鸭防腐效果的研究[J]. 现代食品科技，2013，29(1)：88－90 Zhao Wenhong,Bai Weidong,Zhu Jialei,et al. Effects of chosen preservatives on dominant spoilage bacteria from chilling duck meat[J]. Modern Food Science and Technology,2013,29(1):88－90(in Chinese with English abstract)

[7] 罗士数，刘小玲. 草果提取物对鲫鱼的防腐保鲜研究[J].现代食品科技，2013，29(6)：1285－1287. Luo Shishu,Liu Xiaoling. Preservation effect of Amomum tsao-ko extract on carp[J]. Modern Food Science and Technology,2013,29(6):1285－1287.(in Chinese with English abstract)

[8] 孙卫青，马俪珍，南庆贤. 天然保鲜液对冷却猪肉保鲜效果的研究[J]. 中国农业科学，2007，40(8)：1835－1842. Sun Weiqing,Ma Lizhen,Nan Qingxian. Fresh-keeping effect of natural preservatives on chilled pork[J]. Scientia Agricultura Sinica,2007,40(8):1835－1842(in Chinese with English abstract).

[9] 郝教敏，马俪珍，王如福，等. 多源复合天然保鲜剂对冷却猪肉的保鲜效果[J]. 中国食品学报，2012，12(6)：113－119. Hao Jiaomin,Ma Lizhen,Wang Rufu,et al. Studies on the preservation of chilled pork by mixture natural preservatives solution[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2012,12(6):113－119.(in Chinese with English abstract)

[10] Zhu YC,Ma LZ,Xiong YL. Super-chilling(–0.7 ℃) with high-CO2packaging inhibits biochemical changes of microbial origin in catfish(Clarias gariepinus) muscle during storage[J]. Food Chemistry,2016,206(1):186－190

[11] Ando M,Nakamura H,Harada R,et al. Effect of super chilling storage on maintenance of freshness of kuruma prawn[J]. Food Science and Technology Research,2004,10(1):25－31.

[12] Duun A S,Rustad T. Quality of super-chilled vacuum packed Atlantic salmon(Salmo salar) fillets stored at -1.4 and -3.6 ℃[J]. Food Chemistry,2008,106(1):122－131.

[13] 荣建华，郭姗姗，赵思明，等. 包装方式对冰温保鲜脆肉鲩鱼片品质的影响[J]. 食品科技，2012，37(4)：115－118. Rong Jianhua,Guo Shanshan,Zhao Siming,et al. Effect of different package on the quality of crisped grass carp fillet during ice storage[J]. Food Science and Technology,2012,37(4):115－118(in Chinese with English abstract)

[14] Messina C M,Bono G,Renda G,et al. Effect of natural antioxidants and modified atmosphere packaging in preventing lipid oxidation and increasing the shelf-life of common dolphinfish(Coryphaena hippurus) fillets[J]. LWT - Food Science and Technology,2015,62(1):271－277.

[15] Provincial L,Guillén E,Alonso V,et al. Survival of vibrio parahaemolyticus and aeromonas hydrophila in sea bream(Sparus aurata) fillets packaged under enriched CO2modified [J]. Journal of Food Engineering,2011,104(1),23－29.

[16] Liza J,Daren C,Charles E,et al. Color and thiobarbituric acid values of cooked top sirloin steaks packaged in modified atmospheres of 80% oxygen,or 0.4% carbon monoxide,or vacuum [J]. Meat Science,2005,69(3):441－449.

[17] Zhu S,Luo Y,Hong H,et al. Correlation between electrical conductivity of the gutted fish body and the quality of bighead carp(Aristichthys nobilis) heads stored at 0 and 3 ℃[J]. Food and Bioprocess Technology,2013,6(11):3068－3075.

[18] Oliver C N,Ahn B W,Moerman E J,et al. Aged-related changes in oxidized proteins [J]. Journal of Biological Chemistry,1987,262(12):5488－5491.

[19] Ellman G L. Tissue sulfhydryl groups[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,1959,82(1):70－77.

[20] Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227(5259):680－685.

[21] 李国林，李莉，印大中. TBARS的新应用-表征羰基紧张[J].激光生物学报，2003，12(2)：112－116. Li Guolin,Li Li ,Yin Dazhong. Representing carbonyl stress:a new application of TBARS[J].Acta Laser Biology Sinica,2003,12(2):112－116.(in Chinese with English abstract)

[22] 余灯广，高秋华，胡锦东，等. TBARS法测定胰岛素口腔喷雾剂中脂质过氧化物研究[J]. 分析科学学报，2005，21(1)：78－80. Yu Dengguang,Gao Qiuhua,Hu Jindong ,et al. Investigation of lipid peroxide in insulin buccal spray by thiobarbituric acid reactive substance assay[J].Journal of Analytical Science,2005,21(1):78－80.(in Chinese with English abstract)

[23] Nirmal N P,Benjakul S. Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp(Litopenaeus vannamei) during iced storage[J]. Food Chemistry,2009,116(1):323－331.

[24] Sante-Lhoutellier V,Aubry L,Gatellier P. Effect of oxidation on in vitro digestibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,2007,55(13):5343－5348.

[25] Gardner HW. Lipid hydroperoxide reactivity with proteins and amino acids:A review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1979,27(2):651－656.

[26] Eymard S,Baron C P,Jacobsen C. Oxidation of lipid and protein in horse mackerel(Trachurus trachurus) mince and washed minces during processing and storage[J]. Food Chemistry,2009,114(1):57－65.

[27] Leelapongwattana K,Benjakul S,Visessanguan W,et al. Physicochemical and biochemical changes during frozen storage of minced flesh of lizardfish(Saurida micropectoralis) [J]. Food Chemistry,2005,90(1):141－150.

[28] Xiong YL. Protein oxidation and implications for muscle food quality[M]. USA,NewYork:Wiley,2000:85－111.

[29] Gibis M,Weiss J. Antioxidant capacity and inhibitory effect of grape seed and rosemary extract in marinades on the formation of heterocyclic amines in fried beef patties[J]. Food Chemistry,2012,134(2):766－774.

[30] Roura S I,Crupkin M. Biochemical and functional properties of myofibrils from pre and post-spawned hake(Merluccius hubbsi Marini) stored on ice[J]. Journal of Food Science,1995,60(2):269－272.

[31] Zhou A M,Benjakul S,Pan K,et al. Cryoprotective effects of trehalose and sodium lactate on tilapia(Sarotherodon nilotica) surimi during frozen storage[J]. Food Chemistry,2006,96(1):96－103.

[32] Chantarasataporn P,Tepkasikul P,Kingcha Y,et al. Waterbased oligochitosan and nanowhisker chitosan as potential food preservatives for shelf-life extension of minced pork[J]. Food Chemistry,2014,159(1):463－470.

[33] 李苗苗，王江峰，徐大伦，等. 4种保鲜处理对冰温贮藏金枪鱼片生物胺的影响[J]. 中国食品学报，2015，15(2)：111－119. Li Miaomiao,Wang Jiangfeng,Xu Dalun,et al. Effects of 4 packaging methods on biogenic amines formation in yellowfin tuna(Thunnus albacores)fillets under controlled freezing-point temperature[J]. Journal of Chinese institute of Food Science and Technology,2015,15(2):111－119.(in Chinese with English abstract)

[34] 李静雪，韩建春，孙英杰，等. 天然保鲜剂对冰鲜鲤鱼鱼肉的保鲜效果[J]. 食品工业，2014，35(3)：183－186. Li Jingxue,Han Jianchun,Sun Yingjie,et al. The effect of preservation of carp surimi added natural preservatives during superchilling storage[J]. The Food Industry,2014,35(3):183－186(in Chinese with English abstract)

[35] Hsieh P C,Mau J L,Huang S H. Antimicrobial effect of various of plant extracts[J]. Food Microbiology,2001,18(1):35－43.

[36] Hao YY,Brackett R E,Doyle M P. Efficacy of plant extracts in inhibiting aeromonas hyromonas hydrophila and listeria monocytogenes in refrigerated,cooked poultry[J]. Food Microbiology,1998,15(4):367－378.

[37] Park D,Xiong Y L,Alderton AL,et al. Biochemical changes in myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(12):4445－4451.

[38] Kanatt S R,Chander R,Sharma A. Chitosan glucose complex-A novel food preservative[J]. Food Chemistry,2008,106(2):521－528.

[39] Sameli J,Kakouri A,Rememtzis J. Selective effete of the product type and the packaging conditions on the species of lactic acid bacteria dominating the spoilage microbial association of cooked meats at 4 ℃[J]. Food Microbiology,2000,17(3):329－340.

[40] Schoeman H,Vivier M A,Du Toit M,et al. The development of bactericidal yeast strains by expressing the pediococcus acidilactici pediocin gene(pedA) in Saccharomyces cerevisiae[J]. Yeast,1999,15(8):647－656

[41] Xiong Y L,Decker E A. Alterations of muscle protein functionality by oxidative and anti-oxidative processes[J]. Journal of Muscle Foods,2007,6(2):139－160.

[42] Decker E A,Xiong Y L,Calvert J T,et al. Chemical,physical and functional properties of oxidized turkey white muscle myofibrillar proteins[J]. Agriculture and Food Chemistry,1993,41(2):186－189.

[43] Rowe L J,Maddock K R,Lonergan S M,et al. Influence of early post-mortem protein oxidation on beef quality[J]. Animal Science,2004,82(3):785－793.

[44] Lund M N,Lametsh R,Hviid M S,et al. High-oxygen packaging atmosphere influences protein oxidation and tenderness of porcine longissimus dorsi during chill storage[J]. Meat Science,2007,77(3):295－303.

Effects of different natural preservative on catfish(Clarias gariepinus) fillet quality during storage with combination of super-chilling and high-CO2packaging

Zhu Yingchun1,Ma Lizhen2※,Dang Xiaoyan1,Wang Yang3
(1. College of Food Science and Engineering,Shanxi Agriculture University,Taigu 030801,China;2. Department of Food Science and Biological Engineering,Tianjin Agriculture University,Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing,Tianjin 300384,China;3. College of Fisheries,Tianjin Agriculture University,Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture,Tianjin 300384,China)

In order to extend the shelf life and improve the safety of catfish(Clarias gariepinus) fillets,the fresh catfish fillets were treated with 5% natural preservatives of 3 different formulas respectively. Formula 1(1# ) was composed of 0.5% chitosan,0.1% propolis,0.075% lysozyme,0.075% nisin and 0.5% tea polyphenol,Formula 2(2#) contained 5.6% cinnamon,6% cloves,19.12% ginger and 12.84% garlic,Formula 3(3#) was the supernatant of pure lactic acid bacteria,and the samples treated with sterile distilled water were set as control. The catfish fillets were stored in modified atmosphere packaging(60% CO2/ 40% N2) at -0.7oC,and the influences of natural preservatives on the sensory quality,microbial index and physical-chemical properties and the protein oxidation of catfish fillets during 60 d storage were evaluated. The results proved that the preservatives effectively extended the shelf life of catfish fillets compared with control samples through the sensory analysis,which was carried out based on color,odor,texture,and springiness of raw catfish fillets and odor,taste,and soup clarification of cooked catfish fillets by the ten-point descriptive analysis test. The sensory shelf life(evaluated by the overall sensory scores) for 1#,2#,and 3# samples was 40,30 and 40 d,respectively,while the shelf-life for control samples was only 20 d. Total viable count(TVC) of control sample was always higher than 1#,2# and 3# samples during the whole storage. TVC for control sample exceeded 6.00 log cfu/g after 30 d storage,whereas for 1#,2# and 3# samples TVC exceeded the above number after 50,40 and 50 d,respectively. In the chemical indicators of spoilage,total volatile base-nitrogen(TVB-N) values showed significant increases for all the samples(P<0.05),the value for control sample increased to 22.59 mg/100 g after 40 d storage,whereas the values for samples treated with preservatives were lower than 20.00 mg/100g during the same time of storage. The 2# preservative had excellent antioxidant activity,which was proved by the lower thiobarbituric acid resctive subastances(TBARS) values(0.09-0.14 mg/kg) in 2# samples during the whole storage. The initial potassium(K) value of fresh catfish fillets was 3.10%,and the value increased to 71.70%(for control sample after 40 d),66.36%(for 1# sample after 60 d),89.9%(for 2# sample after 60 d) and 61.28%(for 3# sample after 60 d) at the end of the storage. The study also investigated the effects of natural preservatives on protein oxidation of catfish fillets. The total sulphydryl contents of myofibrillar proteins decreased significantly(P<0.05) from 115.51 nmol/mg protein(0 d) to 54.53,64.23,81.15 and 55.38 nmol/mg protein on the 40thday of the storage for control,1#,2# and 3# samples,respectively. The results suggested significant inhibition of preservatives to disulfide bond formation in catfish protein. In addition,the carbonyl contents increased during the storage in a similar way as the total sulphydryl contents. The sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) analysis revealed that the preservatives reduced cross-linking polymerization and degradation of catfish myofibrillar protein during the storage. In conclusion,the 3 kinds of preservatives could inhibit microorganism growth,protein degradation,protein and lipid oxidation,and thus maintain the freshness and delay the deterioration of catfish fillets. The shelf-life extension efficiency of the 3 kinds of preservatives was in order of 3# >1# >2#,and the shelf-life of 1#,2# and 3# samples was 40,30 and 40 d respectively,while that of control sample was only 20 d. This result provides a reference for the application of natural preservatives in catfish meat during the storage.

storage;packing;quality control;catfish fillet;natural preservative;protein oxidation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.040

TS254.4

1002-6819(2017)-01-0292-09

朱迎春，马俪珍，党晓燕，王洋. 不同天然保鲜液对气调包装冰温贮藏鲶鱼片品质的影响[J]. 农业工程学报，2017，33(1)：292－300.

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.040 http://www.tcsae.org

Zhu Yingchun,Ma Lizhen,Dang Xiaoyan,Wang Yang. Effects of different natural preservative on catfish(Clarias gariepinus) fillet quality during storage with combination of super-chilling and high-CO2packaging[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2017,33(1):292－300.(in Chinese with English abstract)doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.01.040 http://www.tcsae.org

2016-07-18

2016-11-18

天津市水产产业技术体系创新团队-水产品加工及质量安全岗位专家团队；山西省科技攻关项目（20140311025-6）；山西农业大学博士科研启动基金（2015ZZ06）

朱迎春，女(汉族)，山西太谷人，博士，副教授，主要研究方向为肉制品品质与安全。太谷，山西农业大学食品科学与工程学院，030801。Email：yingchun0417@163.com

※通信作者：马俪珍，女(汉族)，博士，教授，主要研究方向为肉制品品质与安全。天津，天津农学院食品科学与生物工程学院，300384。Email：Malizhen-6329@163.com