精子发生中miRNAs调控功能研究进展

陈晓旭，曾文先

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

特别报道

编者按

2017年《中国畜牧杂志》全面改版。为更好展示畜牧学领域的科技前沿，促进学术交流，本刊特别邀请不同领域的专家或青年骨干，围绕各自的研究领域，介绍自己、团队或国际研究机构近几年的研究成果、存在问题及研究展望，或就当前的研究热点问题进行讨论和评论。2017年第一期自副主编开始，将为读者带来相关综述，希望能引发读者对相关热点、难点的思考，并进行深入探讨。

精子发生中miRNAs调控功能研究进展

陈晓旭，曾文先*

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

源源不断的精子发生过程是雄性繁殖机能的基础。精原干细胞（SSCs）持续不断地自我更新和分化又是精子发生的基础。精子发生起始于精原干细胞的分化，历经漫长的减数分裂后形成单倍体圆形精细胞。后者经过变态发育过程，最终形成精子并释放到曲细精管管腔中[1]。研究表明，成千上万的基因参与了精子发生过程，然而如何实现对这些基因精确有效的调控还有待研究。MicroRNAs（miRNAs）作为一类长度为22 nt的单链非编码小RNA，主要参与基因的转录后调控。近年来的研究表明，miRNAs参与调控雄性生殖细胞的增殖、分化以及凋亡。本文主要针对精子发生过程中miRNAs在睾丸不同细胞类型中的调控功能进行综述。

1 miRNAs的生成与作用机制

miRNAs的转录与其在基因组中的位置相关。在众多miRNAs基因中，大约有一半的miRNAs位于基因的内含子中，其转录调控与宿主基因一致或者不依赖于宿主基因。另外，部分miRNAs基因则成簇存在并共有相同的启动子，因此这些miRNAs基因具有相同的转录调控机制[2]。miRNAs基因转录成pri-miRNAs，经过Drosha和DGCR8的加工并生成pre-miRNAs。这些pre-miRNAs会在EXP5-Ran·GTP复合物的作用下运送至细胞质，进一步被Dicer加工成双链的RNA[3]。双链的RNA会在AGO蛋白形成的miRNA诱导沉默复合体中进一步成熟为具有生物学功能的miRNAs。miRNAs调控基因的表达主要通过碱基互补配对的方式诱导mRNA的降解或翻译抑制。这种调控识别方式主要依赖于成熟miRNAs第2～8位碱基的种子序列，因此，1个miRNA可以调控多个基因，同样的1个基因也可被多个miRNAs调控[4]。

最新的研究表明，N6-腺嘌呤甲基化修饰（m6A）参与调控miRNAs的生成。Alarcon等[5]报道，HNRNPA2B1能够结合pri-miRNAs的m6A修饰位点，并与DGCR8结合促进pri-miRNAs的加工；当细胞中缺少HNRNPA2B1或者m6A甲基化酶METTL3时，会导致细胞中未加工的pri-miRNAs水平上升，并降低成熟miRNAs的表达水平。因此，miRNAs生成受到m6A的调控。同时，miRNAs可以通过碱基互补配对的方式调控m6A修饰的形成。这种调控方式主要通过抑制METTL3与mRNA的结合，最终改变mRNA上的m6A修饰水平。m6A修饰水平的微妙变化能够改变mRNA的稳定性，从而调控基因的表达[6]。

2 miRNA在精子发生中的作用

2.1 Dicer条件性敲除模型鼠 Dicer条件性敲除模型鼠已被广泛应用于探究miRNAs在精子发生中的作用。Remero等[7]在出生前小鼠的原始精原细胞中敲除Dicer致使减数分裂异常、粗线期精母细胞凋亡、圆形精子减少以及精细胞形态异常。Koheron等[8]采用NGN3启动子驱动的Cre重组酶在A型精原细胞中敲除Dicer，则导致圆形精子细胞缺失，精子发生严重受阻；在早期精原细胞中Dicer的敲除也表现类似结果；在单倍体精子中敲除Dicer导致延长型精子以及精细胞的形态呈现异常，这些结果均表明miRNAs在精子发生调控中有着重要作用。

2.2 miRNA在精原干细胞自我更新及分化中的作用 SSCs位于睾丸曲细精管基部的微环境中，其自我更新与分化的平衡是确保雄性动物源源不断产生精子的基础，并受到多种因子调控。神经营养因子（GDNF）能够作用于细胞表面的RET和GFRα1受体，激活PI3K/AKT或者SFK信号通路，调控SSCs的自我更新[9]。miRNAs也参与SSCs自我更新调控。研究表明，miR-20、miR-21、miR-34c-135a、miR -146a、miR-182、miR-183、miR -204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在SSCs中高丰度表达[10-11]。其中，miR-20、miR-21和 miR-106a能 够 维 持 SSCs稳 态。Moritoki等[12]研究表明，miR-135a通过转录因子FOXO1的表达变化改变细胞表面膜受体RET蛋白的表达水平，进而调控SSCs的命运。而miR-544及miR-224均能够通过调控转录因子PLZF影响SSCs的自我更新[13-14]。另外，SSCs的增殖则受到miR-34c以及miR-204调控[15-16]。

研究表明，维甲酸能够诱导精原细胞的分化与减数分裂起始。维甲酸能够下调生殖细胞内miR-146、let7家族、miR-17-92、miR-106b-25和 miR-221/222表达水平[17-19]。其中，敲除miR-17-92导致SSCs以及精原细胞数量减少，并造成精子发生受损[19]。过表达miR-221/222能够抑制维甲酸诱导的精原细胞分化。此外，miR-34c靶向于NANOS并上调减数分裂相关基因，从而调控SSCs的分化和减数分裂过程[20]。

2.3 miRNA调控减数分裂以及精子变态发育 越来越多的证据表明miRNAs参与减数分裂的调控。miR-449 和miR-34b/c的表达水平均随着减数分裂的开始而上调。由于miR-449和miR-34b/c的种子序列相同，它们在调控精子发生中的作用有重叠，因此只有同时敲除miR-449和miR-34b/c才能导致精子发生障碍[21]。同时，miR-34b-5p能够调控Cdk6的表达以调控减数分裂过程[22]。类似地，miR-18作为精母细胞中高丰度表达的miRNA，也通过调控Cdk6调控精子发生过程[23]。

精子发生中组蛋白依次被过渡蛋白（TPs）以及精蛋白（PRMs）替换是雄性生殖细胞特有的发育过程[24]。在减数分裂后期的生殖细胞中，TPs以及PRMs的精确表达是精子变态发育的先决条件。因此，为了确保这一过程准确而有效地进行，TPs和PRMs受到严格的转录后调控。现已证实，miR-469能够抑制粗线期精母细胞以及圆形精子中TP2和PRM2的表达[25]，而miR-122a则是在生殖细胞后期高丰度表达且调控TP2基因的表达[26]。

尽管大量的miRNAs会在精子变态发育过程中丢失，但是精子中残余的miRNAs同样具有重要功能。miR-34c参与受精卵第1次分裂过程[27]，而精子中miR-424/322的表达紊乱诱导精子中双链分子的断裂[28]。通过探究弱精子症患者与正常人中精子表达的差异，人们确定了一些潜在的可作为不孕标记的miRNAs。以miR-151a-5p为例，miR-151a-5p在弱精子症患者中高表达且参与线粒体的生物学功能[29]。

2.4 miRNA在睾丸体细胞中的功能 精子发生同样依靠睾丸体细胞的参与，来源于支持细胞和间质细胞的细胞因子能够调控精子发生过程。因此，miRNAs对睾丸体细胞的调控也可影响精子发生过程。有研究指出，激素可诱导支持细胞miRNAs的表达水平变化，从而改变支持细胞的状态。例如雌二醇可诱导支持细胞miR-17和miR-1285的表达变化，从而调控支持细胞的增殖[30-31]。这种对于支持细胞增殖的调控也可通过miR-133b[32]和miR-762[33]的表达变化实现。睾丸间质细胞主要负责雄激素的生成，促黄体生成素（LH）诱导的雄激素生成过程会受到miRNAs的调控。miR-140-5p/3p能够控制小鼠睾丸间质细胞的数量，miR-140-5p/3p的缺失会导致间质细胞数量的增加[34]。

总的来说，miRNA通过调控支持细胞以及间质细胞的发育与功能，为SSCs的自我更新和分化创造了一个合适的微环境，为SSCs提供了结构以及营养支持。因此，睾丸体细胞中miRNAs同样在精子发生过程中有着重要的作用。

3 总结与展望

精确而有效地调控基因表达是精子发生正常进行的先决条件。研究证实，miRNAs在特定的细胞类型或精子发生阶段中表达，然而其中大部分miRNAs在精子发生中的功能还未阐明。第一，将来的研究可借助单细胞测序的方法，可更为准确地揭示特定生殖细胞类型中miRNAs的表达特点。条件性敲除技术以及CRISPR/Ca9技术的出现将能够进一步加快关于miRNAs功能的研究。第二，miRNAs在睾丸组织体细胞中的表达特点和作用还有待进一步阐明。睾丸体细胞中的miRNAs能否以旁分泌的方式分泌到SSCs微环境中，miRNAs能否调控睾丸体细胞生长因子的分泌进而影响生殖细胞发育，都需要进一步探究。第三，转录因子既能够调控SSCs的自我更新，也能够调控SSCs的分化，然而miRNAs调控转录因子表达的作用机制还需更深入研究。第四，m6A能够调控pri-miRNAs的加工，这为探究miRNAs生成调控和作用机制拓展了新的视野。在将来的研究中，探究生殖细胞发育中RNA表观修饰的变化将为更深刻地理解精子发生提供理论基础。最后，一些miRNAs已经被筛选为雄性不育的标记分子，阐明不孕不育患者中miRNAs标记分子的致病机理将有助于为男性不育提供新的疗法。总之，揭示这些问题将有助于更为深刻地认识和理解miRNAs在精子发生中的生物学作用。

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10.19556/j.0258-7033.2017-12-001

国家自然科学基金（31272439、31572401）

陈晓旭（1992- ）男，博士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：chenxiaoxu1992@outlook.com

*通讯作者：曾文先，教授，博士生导师，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：zengwenxian2015@126.com