PICU重症肺炎患儿机械通气后肺泡灌洗液NF-κB表达及炎性因子水平变化的研究

周茉 陈建丽 徐艳霞 陈敏

(贵州省妇幼保健院/贵阳市儿童医院儿童重症医学科，贵州 贵阳 550003)

PICU重症肺炎患儿机械通气后肺泡灌洗液NF-κB表达及炎性因子水平变化的研究

周茉 陈建丽△徐艳霞 陈敏

(贵州省妇幼保健院/贵阳市儿童医院儿童重症医学科，贵州 贵阳 550003)

目的 观察PICU重症肺炎患儿机械通气后支气管肺泡灌洗液(BALF)中核因子-κB (NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-2)的表达及炎性因子水平的变化。方法 将60例患儿分为好转和恶化两组，采用固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测肺泡灌洗液中TNF-α水平和人巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)因子水平；用NF-κB免疫组化试剂盒测定NF-κB的表达情况。同时于机械通气第2、 6天及拔管后第2天记录呼吸力学指标，行X线检查，记录生命体征、血气分析、生命体征及胸片等综合分析。结果 好转组患儿BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达在机械通气后第6天及撤机后第2天明显下降(P<0.01)，肺组织损伤情况明显改善；反之，恶化组相关数据呈明显上升趋势(P<0.01)。机械通气后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性细胞因子的表达与由机械通气所致的肺生物伤呈正相关性。结论 炎症反应为呼吸机相关性肺损伤的主要发病机制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达与VILI的发生、发展和预后有密切关系。监测上述细胞因子水平的变化，有助于改善预后、减轻机械通气所致的肺生物伤。

PICU； 重症肺炎； 肺泡灌洗液； 细胞因子

由机械性通气引起的肺组织损伤(ventilator-inducedlung injury，VILI)主要的病理学特征为高通透性的肺水肿、中性粒细胞的聚集活化、肺泡出血及肺泡隔明显增厚[1]。近年来，关于机械通气造成的生物伤激活了炎症细胞，并释放了各类细胞因子及炎性介质，从而引发肺损伤的相关研究有了迅速发展[2]。就目前已发现的，参与肺损伤的炎症细胞所释放的细胞因子及炎性介质就多达十几种，其中研究得最多的炎症细胞分别是巨噬细胞和中性粒细胞，所涉及的细胞因子主要为TNF-α、IL-1β和IL-8等。这些炎症细胞与细胞因子之间相互激活、相互作用，从而构成了一个非常庞大且复杂的网络体系，不仅可引起肺损伤，且可通过血液循环释放到全身，从而引起多器官功能发生障碍(MODS)[3-4]。本研究通过持续对患儿BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达及炎性因子水平的变化进行检测，探讨它们能否作为评估肺生物伤发生、发展的量化指标。

1 资料与方法

1.1 资料

选择2013年12月至2014年12月在我院PICU住院并进行机械通气且撤机1周后存活的重症肺炎患儿60例，女性36例，男性24例；年龄0.5～13岁，平均(5±4.7)岁。60例患儿均符合儿科重症肺炎诊断标准[5]。所有对象在纳入前其父母或监护人均填写知情同意书并获得患儿同意。

1.2 方法

根据临床表现、呼吸力学指标血气分析、生命体征及胸片等综合分析，将60例患儿分为好转及恶化两组，每组30例。于应用机械通气的第2、6天及撤机后第2天对其BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2水平分别进行检测和浓度对比，同时记录潮气量(VT)、每分通气量(MV)、动态肺顺应性(Crs)、呼气阻力(R)、呼吸做功(WoB)等呼吸力学指标；行影像学检查；记录体温(T)、心率(HR)、呼吸(R)、经皮动脉氧饱和度(SPO2)、血压(BP)等生命体征；血气分析：动脉二氧化碳(PaCO2)、动脉氧分压(PaO2)；并计算氧合指数。重症肺炎治疗按第7版《诸福棠实用儿科学》有关诊疗指南进行。

1.3 BALF标本采集和标本制备

患儿在充分镇静下经气管插管行支气管肺泡灌洗术，灌洗时将37℃生理盐水1 mL/(kg·次)注入气管插管，复苏囊加压给氧，充分拍背后将灌洗液回抽，共灌洗2～3次，回收率>40%。取患儿双侧肺BALF，超低温冷冻后送重庆金麦生物技术有限公司进行相关实验室检测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)分别检测第2、6天及撤机后第2天的NF-κB、TNF-α、MIP-2水平变化。TNF-alpha、MIP-2试剂盒均代购于eBioscience 公司，NF-kB试剂盒代购于Active motif 公司。

1.4 统计学方法

2 结 果

两组患儿插管后第2天各细胞因子表达水平无明显差异(P>0.05);插管后第6天好转组细胞因子表达水平呈下降趋势、恶化组呈上升趋势(P<0.01)；撤机后第2天两组各细胞因子水平差异有统计学意义(P<0.01)，且好转组各项指标随着时间的延长，其表达水平呈递减趋势，反之，恶化组呈递增趋势。见表1。

表1 两组患儿机械通气第2、6 d各细胞因子表达水平的比较(n=30)

注：插管后2 d比较*P>0.05；与插管后6 d比较：△P<0.01；与撤机后6 d比较▲P<0.01。

两组患儿插管后第2天与第6天比较，各细胞因子表达水平差异均有统计学意义(TNF-α，P<0.05；NF-κB、TNF-α、MIP-2，P<0.01)。插管后第6天与撤机后第2天比较，两组NF-κB、TNF-α、MIP-2水平差异均有统计学意义(P<0.01)。插管后第2天与撤机后第2天比较，两组NF-κB、TNF-α、MIP-2差异亦均有统计学意义(P<0.01)。其中好转组患儿NF-κB、TNF-α、MIP-2在机械通气撤机后第2天较插管后第2天明显下降(P<0.01)，三项指标随着时间的延长呈递减趋势；而恶化组患儿三项指标同期明显升高(P<0.01)，并随着时间的延长呈显著上升趋势。见表2。

表2 两组患儿机械通气第2、6天各细胞因子表达水平的组内比较

注：插管后6 d与插管后2 d比较☆P<0.05,*P<0.01；撤机后2 d与插管后6 d比较△P<0.01；撤机后2 d与撤机后2d比较▲P<0.01。

3 讨 论

VILI早期表现为机械性损伤，随后可演变为以炎性细胞、细胞因子介导的生物伤[6]。有研究显示，中性粒细胞是引起VILI的主要炎症细胞，它在肺组织中聚集活化，并释放大量的蛋白溶解酶、氧自由基及细胞因子等物质，当这些物质的释放量超出机体的清除能力时，就会导致肺组织的病理性损伤[7]。

机械应力激发刺激自由基的产生，从而促进P-选择素的胞外分泌，同时通过NF-κB激活后刺激血管细胞粘附分子的产生和炎症反应[8]。有关实验数据表明，NF-κB的信号转导通路可介导机械通气所致肺生物伤时许多细胞因子和炎性介质的释放[9-10]。NF-κB还可活化结合编码细胞因子如TNF-α等基因的启动子或增加子的κB结合位点，调节这些基因的表达，进一步促进机械性肺损伤的发生。

大量实验结果表明，TNF-α作为一种前炎症细胞因子，不仅能增强中性粒细胞及嗜酸粒细胞的功能，还可以对其周围细胞产生毒性作用，同时它也是一种十分重要的炎症级联反应的调节因子，在VILI的发病机制中起到十分重要的作用[11-12]。此外，有关实验数据[13]表明， MIP-2在趋化中性粒细胞的聚集活化中起主导作用。

VILI不仅仅包括机械性损伤，还包括由多种炎症细胞、细胞因子和炎性介质参与的生物性损伤。机械性损伤可诱发生物性损伤，而生物性损伤反过来又可加重机械性损伤，两者相辅相成、相互促进。尽管呼吸机所致肺生物性损伤涉及的炎症细胞和炎性因子很多，关系非常复杂，但它们可能通过共同的炎症反应通路而引起肺组织损伤。本研究结果显示，机械通气后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达与肺生物伤呈正相关性，具体表现为随着重症肺炎患儿病情的好转或恶化，炎性细胞因子NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达也分别呈显著递减或上升趋势。炎症反应为VILI的主要发病机制，NF-κB、TNF-α、MIP-2的表达与VILI的发生、发展和预后有密切关系。监测对比机械通气后BALF中NF-κB、TNF-α、MIP-2炎性细胞因子水平的变化，可作为判断重症肺炎患儿行机械通气及药物治疗后疗效及疾病转归的方法之一以及可在临床上操作的一项量化指标；而对上述炎性细胞因子水平呈显著上升趋势者，应警惕病情有恶化的趋势，需进一步寻找恶化原因并及时调整治疗方案，这对改善预后、减轻VILI有一定的帮助。

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Study on the expression of NF-κB and inflammatory factor in Broncho alveolar lavage fluid after mechanical ventilation in children with severe pneumonia in PICU

ZhouMo,ChenJianli*,XuYanxia,ChenMin.

PediatricIntensiveCareUnit,GuizhouProvincialChildren'sHospital,MaternalandChildHealthCareHospitalGuiyang550003,Guizhou,China.

Objective To observe the changes of clinical index, to explore the possibility of the expression of nuclear factor-κB(NF-κB), tumor necrosis factor alpha(TNF-α), macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) inflammatory factor genes, by observing the Broncho alveolar lavage fluid(BALF)in children with pneumonias in the PICU, as the quantitative indices of the development lung biotrauma. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to check the expressions of TNF-α and MIP-2 in BALF 2 days and 6 days after mechanical ventilation and 2 days after extubation. The expression of NF-κB protein in lung tissues was detected by immunohistochemistry for measurement. And at the same time，the parameters of respiratory mechanics, arterial blood gases and chest X-ray were monitored. In accordance with the analyses of the aforementioned data, sixty cases were divided into two groups, 30 cases in each. One was the improvement group, and the other was deterioration group. Results Compared to the improvement group 2 days after mechanical ventilation，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of patients in improvement group 6 days after mechanical ventilation significantly decreased (P<0.01)，and the pulmonary function significantly improved after 6 days of treatment． For patients in the deterioration group，the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF were significantly elevated (P>0.01) after 6 days of mechanical ventilation compared to 2 days later. The positive correlation between the expressions of TNF-α，NF-κB and MIP-2 in BALF of patients undergoing mechanical ventilation and the lung injury caused by mechanical ventilation. With the improvement of disease, the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 in BALF of the children with pneumonias significantly decreased. With the deterioration of disease, those expressions of inflammatory factors rose significantly.Conclusion Inflammatory response is the major pathogenesis of ventilation induced lung injury (VILI), there is close relationship between the expressions of TNF-α, NF-κB and MIP-2 and the development of VILI. And can be used to judge the curative effect and prognosis of the patients.

Pediatric intensive care (PICU)； Severe pneumonia； Broncho alveolar lavage fluid； Cell factor

贵阳市卫生局科学技术计划项目及高层次创新型青年卫生人才培养计划项目(筑卫科技合同字[ 2013 ]第创17号)

R725.6

A

1000-744X(2016)08-0807-03

2016-03-09)

△通信作者，E-mail：1165438489@qq.com