IMP3、EGFR和P53蛋白在神经胶质瘤组织中的表达

谢欣 褚明亮 陈祎 张著学 杨迎春 易韦△ 于燕妮△

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属人民医院，贵州 贵阳 550002)

IMP3、EGFR和P53蛋白在神经胶质瘤组织中的表达

谢欣1褚明亮2陈祎2张著学2杨迎春2易韦2△于燕妮1△

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属人民医院，贵州 贵阳 550002)

目的 检测IMP3、EGFR、P53蛋白在神经胶质瘤组织中的表达，研究其与患者预后的关系。方法 收集胶质瘤标本185例和20例因脑血管畸形手术切除的正常脑组织，采用免疫组化S-P二步法检测IMP3、EGFR和P53的表达情况，并结合患者生存时间进行统计学分析。结果 IMP3、EGFR和P53在对照组中表达极低，在胶质瘤组织高级别组中表达水平均明显高于低级别组。且三者表达呈显著正相关。单因素及COX多因素模型分析表明，IMP3的表达可作为患者预后的独立危险因素，EGFR的表达对患者预后存在一定影响，但不可作为预后独立危险因素。结论 IMP3、EGFR和P53的联合检测可能成为胶质瘤生物标记的新指标，IMP3、EGFR可能成为脑胶质瘤治疗的特异靶点。

神经胶质瘤； 免疫组化； 胰岛素样生长因子IImRNA结合蛋白3； 表皮生长因子受体； 抑癌基因P53蛋白

脑神经胶质瘤是颅内常见肿瘤，呈浸润生长，术后易复发，目前治疗效果较差。胰岛素样生长因子IImRNA 结合蛋白3 ( insulin-like growth factor-II mRNA-binding protein 3，IMP3)是IGF-IImRNA的翻译激活子，通过上调IGF-IImRNA的翻译进而促进肿瘤细胞的增生，与肿瘤的发生发展密切相关[1]。表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor, EGFR)基因的编码产物是一种具有酪氨酸激酶(tyrosines kinase,TK)活性的跨膜蛋白受体，在多种恶性肿瘤组织中表达增多,能诱导肿瘤细胞增殖和侵袭[2]。p53为抑癌基因，其基因突变是脑胶质瘤中最常见的基因突变，最终能导致肿瘤的恶性转化[3]。本实验旨在通过检测神经胶质瘤组织中IMP3、EGFR及P53的表达情况，分析三者与胶质瘤病理分级及患者术后生存时间的关系，并探讨三者间的关联性。

1 资料与方法

1.1 资料与试剂

收集贵州省人民医院病理科胶质瘤石蜡组织标本185例，其中男113例，女72例；年龄4～75岁，中位年龄46岁。所有患者术前均未行放、化疗。根据2007年WHO中枢神经系统肿瘤分级标准，分为低级别组(Ⅰ-Ⅱ级)85例，高级别组(Ⅲ-Ⅳ级)100例。另取因脑血管畸形手术切除中的非瘤脑组织(白质)20例作为对照组。收集2012-2013年临床胶质瘤患者临床资料并进行随访，入组标准：胶质瘤初发病例，诊断明确，临床资料完整；手术镜下全切除。排除标准：确诊为胶质瘤，同时患有其它系统严重疾病；组织石蜡标本过小。

主要试剂：兔抗人IMP3多克隆抗体(工作浓度1∶100)、兔抗人EGFR多克隆抗体(工作浓度1∶100)、兔抗人P53多克隆抗体(工作浓度1∶100)，购于北京博奥森生物技术公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水温箱(上海跃进实验设备有限公司)；Leica RM2135石蜡切片机(德国Leica公司)；低温冰箱(青岛海尔集团)；光学显微镜(DM2700 M)(德国Leica公司)；加样器(日本Nichimate 公司)；玻片及盖玻片(北京中杉金桥生物技术有限公司)；5810-R型台式冷冻离心机(德国Eppendorf Germany公司)。

1.3 免疫组化方法

采用免疫组化S-P法，均以PBS代替一抗及探针作为阴性对照，试剂公司提供阳性对照。IMP3和EGFR阳性信号定位在肿瘤细胞胞质内，为棕黄色颗粒；P53阳性表达在细胞核，着色棕黄色；根据着色强度及阳性百分比进行评分：无色为阴性，计0分；淡黄色为弱阳性，计1分；棕黄色为中等阳性，计2分；棕褐色为强阳性，计3分。阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，两者相乘为免疫组化半定量评价标准：≤4分为低表达，>4分为高表达。

1.4 随访方法

采用电话联系方式进行随访，截止时间：2015年5月。随访内容包括：一般情况；是否复发及复发后是否继续治疗；是否存活，若死亡，具体死亡原因及时间。总生存期计算从患者第一次手术时间开始到随访截止日期或患者死亡日期为止。共获访65例，其中54例死亡，11例生存。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS19.0软件包进行分析，计数资料差异性分析采用四格表χ2检验及连续校正和Fisher精确法，关联性分析采用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier单因素分析及Cox回归多因素模型分析。P<0.05示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IMP3、EGFR、P53蛋白在各组中表达情况

IMP3、EGFR和P53蛋白在20例对照组中表达极低或不表达；在脑神经胶质瘤组织高级别组中的表达率均明显高于低级别组(χ2=26.673，χ2=18.846，χ2=13.812，P均<0.001)，且阳性表达程度均随肿瘤级别增高而增高(rs=0.391，rs=0.330，rs=0.284)。见表1、图1。

注：a连续校正。

图1 免疫组化检测IMP3、EGFR和P53在神经胶质瘤中的表达(×100)

2.2 IMP3、EGFR和P53表达强度间的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示， IMP3、EGFR与P53表达水平皆呈正相关(rs=0.197，rs=0.477，P均<0.01)，且IMP3表达与EGFR表达水平呈显著正相关(rs=0.374，P<0.001)。见表2。

表1 IMP3、EGFR和P53表达强度间的相关性

2.3 IMP3、EGFR和P53表达对患者生存期的影响

Kaplan-Meier生存分析结果显示，65例随访者中，IMP3和EGFR 高表达的患者总生存时间均低于低表达患者(Log-rank=15.389，Log-rank=4.230，P均<0.05，见图2a、图2b)。但P53高表达患者与低表达患者术后生存时间差异无统计学意义(P>0.05,见图2c)。运用多变量Cox比例风险回归分析影响胶质瘤预后的危险因素，结果显示胶质瘤组织中IMP3蛋白的表达可作为患者预后的独立危险因素，虽单因素分析显示EGFR对患者预后存在影响，但多因素分析显示其暂不作为胶质瘤预后的独立危险因素。P53的表达对患者预后无明显影响。见表3、表4。

βSβWaldχ2RR395．0%CIRRPIMP31．1270．30213．9041．707，5．5823．0870．000EGFR-1．0270．7262．0030．086，1．4850．3580．157P530．9790．7951．5180．561，12．6362．6620．218

表4 Cox回归自变量赋值情况

3 讨 论

IMP3是癌胚mRNA 结合蛋白，为VICKZ 家族[4]成员，在胚胎早期组织中呈高表达，但在成人正常组织中表达极低。在肿瘤发展中，IMP3是IGF-IImRNA的翻译激活子，通过上调IGF-IImRNA的翻译促进肿瘤细胞的增生。IMP3基因编码产物通过结合目的信使RNA如IGF-2，调控RNA的转录及转录后控制[5-6]。一方面，具有抗凋亡、使恶变倾向的细胞逃避凋亡而形成肿瘤，另一方面IGF2可通过甲硫氨酸脑啡肽信号传导系统上调肿瘤细胞中VEGF的表达,促进肿瘤血管的形成[7]。本研究结果显示，IMP3蛋白的表达随胶质瘤级别增高而增高(P<0.01)，高级别组表达显著高于低级别组(P<0.001)。且IMP3蛋白的表达对患者预后有明显影响，多变量Cox比例风险回归分析提示，可将其作为预后的独立监测因子。结果均提示IMP3蛋白与脑胶质瘤的发生发展和预后密切相关。

EGFR/ErbB-1/HER1是一种具有TK活性的跨膜蛋白受体，其基因位于人第7号染色体短臂，含28个外显子[8]，包含细胞外配体结合区、跨膜区和细胞内激酶区[9]。目前研究已发现多条EGFR下游信号传导分子通路，其主要通路有三条：Ras/Rsf/MEK/MAPK通路、PI3K/PDK1/AKT/mTOR通路和JAK/STAT通路。这三条通路间存在广泛联系，相互影响，构成一个复杂的信号网共同参与到肿瘤的形成中[9]。同时对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究[10]发现，EGFR可通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节影响肿瘤血管生成。本研究结果显示，EGFR蛋白表达随胶质瘤级别增高而增高(P<0.01)，高级别组表达显著高于低级别组(P<0.001)，很好地反映了EGFR的生物学特性。患者预后分析结果显示，EGFR蛋白的表达对患者预后存在一定影响，但多变量Cox比例风险回归分析结果暂不支持将其作为胶质瘤的独立监测因子。

P53基因位于染色体17p13.1，属于抑癌基因，分野生型和突变型两种，其编码产物为P53蛋白，是由393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白[11]。P53基因的突变与多种肿瘤发生有关[12-13]，稳定的突变型P53蛋白可通过免疫组化检测出。在对儿童胶质瘤研究中一部分检出了P53基因的突变，且约半数病例中P53呈显著表达[14]。也有研究[15-16]显示胶质母细胞瘤中P53突变率高达35%～60%。本研究结果显示，P53蛋白表达随胶质瘤级别增高而增高(P<0.01)，高级别组表达显著高于低级别组(P<0.001)，患者预后分析显示，P53蛋白的表达虽对患者预后有一定影响，但暂不可作为预后的独立危险因素。

本研究结果还显示，IMP3与EGFR的表达呈显著正相关，提示在胶质瘤发展过程中，IMP3与EGFR可能存在一定协同作用。目前研究发现，二者均可通过相关通路使血管内皮生长因子(VEGF)表达水平增高，从而促进肿瘤血管生成，进一步为肿瘤生长提供营养，加速肿瘤细胞增殖，形成恶性循环[7,10]。相关分析还显示，EGFR与P53表达亦呈显著正相关，说明二者可能协同参与了胶质瘤的恶性转变，这也可能与P53的突变引起EGFR的过表达有关；但还需进一步研究加以明确。同时本研究结果还显示IMP3表达与P53表达亦呈正相关性，提示三者与胶质瘤的发展关系非常密切，对三者的联合检测可能对胶质瘤分级提供帮助。

综上所述，胶质瘤的发生发展是一个多步骤多因素相互作用的过程，IMP3、EGFR和P53蛋白的表达其关系密切，三者联合检测可能成为胶质瘤生物标记的新指标，IMP3和EGFR的靶点治疗有望成为胶质瘤的有效治疗方案。

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Study on the detections of IMP3, EGFR and P53 in glioma and their relationships with the prognosis

XieXin1,ChuMingliang2,ChenYi2,ZhangZhuxue2,YangYingchun2,YiWei2,YuYanni1.

1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China. 2.People'sHospitalofGuizhouMedicalUniversity, 550002,Guizhou,China.

Objective To investigate the expressions and clinical significance of IMP3, EGFR and P53 protein in glioma. Methods Expression of IMP3, EGFR and p53 were analyzed by S-P immunohistochemsitry in 185 cases of gliomas and 20 cases of normal brain tissues. Kaplan-Meier and multivariate analysis of Variance was used to analysis the survival rate of patients with gliomas. Results Positive expression rate of IMP3, EGFR and P53 in glioma tissue were higher than those in normal brain tissue. The expression rate of IMP3, EGFR and p53 were positively correlated with the pathologic stage. Meanwhile, there was a significantly positive correlation between IMP3, EGFR and IGF2. Histological grading and expression of IMP3 were the independent risk factors of prognosis of glioma, there was a certain effect on the prognosis of patients for EGFR, but it is not an independent risk factor for prognosis.Conclusions Combined detection of IMP3, EGFR and P53 may be new markers of glioma, and IMP3 and EGFR might be possible novel targets for molecular treatment of gliomas.

Glioma; Immunohistochemistry; IMP3; EGFR; P53

贵州省科技厅基金资助课题 (黔科合字LH[2014]7017号)

R R739.41

A

1000-744X(2016)08-0794-04

2016-06-21)

△通信作者，E-mail：yiwei6252@sina.com(易韦)；gyyxybl2010@163.com(于燕妮)