瑞舒伐他汀对扩张型心肌病大鼠心肌组织赖氨酰氧化酶表达水平的影响

刘会 杨龙△ 荣季冬 蒋智 王纪人

(1.贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳 550002； 2.遵义医学院附属医院心内科，贵州 遵义 563003)

·论 著·

瑞舒伐他汀对扩张型心肌病大鼠心肌组织赖氨酰氧化酶表达水平的影响

刘会1杨龙1△荣季冬2蒋智1王纪人1

(1.贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳 550002； 2.遵义医学院附属医院心内科，贵州 遵义 563003)

目的 探讨瑞舒伐他汀对扩张型心肌病大鼠心肌组织赖氨酰氧化酶(LOX)表达的影响。方法 成年大鼠50只，随机分为三组：对照组(NS组：n=10只，腹腔注射等量生理盐水)；扩张型心肌病模型组(DCM组：n=20，腹腔注射阿霉素)；干预组(GY组：n=20，腹腔注射阿霉素，同时给予瑞舒伐他汀灌胃)。10周末处死大鼠，HE、Masson染色测定心肌组织胶原纤维化情况；提取左室心肌组织RNA及蛋白质，RT-PCR法及Western blot测定心肌组织LOX的mRNA及蛋白表达水平。结果 HE、Masson染色显示DCM组大鼠心肌组织明显纤维化，而GY组大鼠心肌组织纤维化程度较轻；DCM组大鼠心肌组织LOX的mRNA及蛋白表达水平明显高于NS组(P<0.01)；与DCM组相比， GY组心肌组织LOX的mRNA及蛋白的表达明显下调(P<0.01)。结论 瑞舒伐他汀可逆转DCM大鼠心肌组织纤维化及LOX的表达。

扩张型心肌病； 蛋白赖氨酰氧化酶； 瑞舒伐他汀

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一种病因未明的心肌疾病，好发于青壮年，预后极差，严重影响患者的生存质量；其主要病理特征是心肌细胞变性、坏死，心肌间质中胶原纤维大量增生、排列紊乱，导致心肌组织重塑及心功能不全。赖氨酰氧化酶(lysyl axidase,LOX)在胶原纤维和弹性纤维的活化和表达中具有重要的作用，参与很多心血管疾病的发生发生发展[1]。在心肌梗死后心室重塑过程中，心肌纤维化程度越重，LOX表达水平越高。目前的研究多涉及LOX在心肌组织重塑中的表达变化情况，而关于药物干预后LOX表达变化国内外相关报道较少。本实验旨在观测瑞舒伐他汀对DCM大鼠心肌组织胶原纤维及LOX表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组

8周龄、SPF级雄性SD大鼠50只[合格证号：SCXK(渝)2012-0005]置于室温22～25 ℃、相对湿度45%左右的动物房内饲养，颗粒饲料[合格证号：SCXK-(粤)2008-0002]喂养，均自由饮水。随机分为三组：对照组(NS组：n=10)，腹腔注射等量生理盐水；扩张型心肌病模型组(DCM组：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累计剂量15 mg/kg；干预组(GY组：n=20)，腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，累计剂量15 mg/kg，同时给予瑞舒伐他汀3 mg/kg·d-1灌胃。

1.2 心脏超声检测

10周末，10%水合氯醛(4 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，8% Na2S脱去大鼠胸部皮毛。采用VisualSonics Vevo770超声心动图仪17.5 MHz探头(加拿大Visual Sonics公司)测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩未期内径(LVESd)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)。

1.3 组织标本处理及HE、Masson染色

大鼠麻醉状态下开胸取出心脏，去掉残余的大血管及心外膜，去除右心室和右心房，保留室间隔，冷肝素盐水洗净心腔内残余的血液。垂直心脏左心室长轴将心脏一分为二，心底部冻存于液氮中检测RNA和蛋白质，心尖部用于HE染色。常规石蜡包埋后制成5 μm厚的切片，行HE、Masson染色。采用Nikon Eclipse 80i 显微镜对所得切片进行观察并采集图像。

1.4 RT-PCR法检测

提取冻存心肌组织总RNA，计算总RNA的浓度和纯度。取1 μg总RNA按逆转录试剂盒说明书方法合成cDNA，产物按PCR试剂盒说明书方法进行PCR反应。所有引物均参造Genebank提供的序列，由大连晨钰生物有限公司合成。β肌动蛋白(β-actin)上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，扩增片段为150bp；LOX上游引物:5’-ATGCCAGCACACAGAGGAGAG-3’，下游引物：5’-AGGCGTGATGTCCTGTGTAGC-3’，扩增片段为300 bp，反应体系为25 μL， 95℃变性25 s，52℃ 退火35 s，72 ℃ 延伸65 s，共循环42次。PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳，以Bio-Image Analysis System分析各条带的光密度值，计算目的条带与内参(β-actin)的比值，以此作为目的基因的相对表达量。

1.5 Western Blot法检测

提取大鼠心肌组织全蛋白，测定蛋白浓度。取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白及转膜，15%脱脂牛奶-PBST溶液室温下封闭60 min，然后将膜与一级抗体(β-actin∶鼠抗单克隆抗体，1∶2 000；LOX∶羊抗人多克隆抗体，1∶500；)在4 ℃结合过夜，次日PBST洗膜10 min×5次，加入HRP标记的二级抗体(β-actin∶山羊抗小鼠，1∶20 000；LOX∶兔抗羊，1∶2 000；)室温下结合60 min，PBST洗膜10 min×5次，ECL法发光显像，X线压片曝光，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统进行灰度分析，用目标蛋白的灰度值比β-actin的灰度值，所得数值代表目标蛋白的相对含量。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 心衰症状

经腹腔注射阿霉素后，DCM组及GY组大鼠逐渐出现心衰症状，活动量减少，进食量下降，并出现不同程度脱毛、紫绀及水肿。

2.2 各组大鼠超声心动图比较

与NS组比较，DCM组、GY组大鼠心脏普遍扩大，心脏室壁运动减弱，左心室收缩及舒张功能明显下降，表现为LVEDd和LVESd明显增加，LVEF及%FS明显下降；与DCM组比较，GY组LVEDd和LVESd有所下降，LVEF及%FS有所回升(P<0.05)。见表 1。

表1 各组大鼠心脏超声参数变化±s)

注：与NS组比较，aP<0.05，bP<0.05。

2.3 HE染色

与NS组比较，DCM组和GY组大鼠心肌细胞水肿，排列紊乱，细胞间隙增宽，可见心肌纤维断裂；与DCM组相比，GY组心肌损害有所减轻。见图1。

注：a.NS；b.DCM；c.GY图1 各组大鼠心肌组织HE染色

2.4 Masson染色

与NS组比较，DCM组和GY组大鼠心肌组织均有明显纤维化，而GY组心肌组织纤维化有所减轻。见图2。

注：a.NS；b.DCM；c.GY图2 各组大鼠心肌组织Masson染色

2.5 各组大鼠心肌组织LOX mRNA和蛋白表达水平的比较

与NS组比较，DCM组大鼠心肌组织LOX mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.01)；与DCM组比较，GY组大鼠心肌组织LOX mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。见图3、表2。

M.Maker；1：NS；2：DCM；3：GY 1：NS；2：DCM；3：GY 图3 各组大鼠心肌组织LOX mRNA和蛋白表达的比较

组别鼠(n)LOX(mRNA)LOX蛋白NS组100．54±0．030．56±0．03DCM组200．85±0．02a0．80±0．04aGY组200．66±0．02b0．67±0．02b

注：与NS组比较，aP<0.01；与DCM组比较，bP<0.01。

3 讨 论

DCM是一种以全心扩大伴收缩功能障碍为典型特征的心肌病，病程呈进行性恶化，预后较差，病理特征是心肌细胞变性、坏死及心肌间质中胶原纤维大量增生。心肌组织重塑的过程贯穿DCM发病的始终。

LOX是胶原纤维和弹性纤维通过共价交联取得稳定性和发育成熟的关键酶，具有稳定细胞外基质免受MMP降解的功能[2]。LOX表达过少，组织力学性能不足；但LOX表达过多，易致组织胶原沉积及纤维化[3]。过度的胶原沉积可引起心肌纤维化，降低心脏舒张功能，最终导致心力衰竭。此外，有研究[4]表明，心肌组织LOX表达上调与慢性心力衰竭左室顺应性降低有关，LOX过度表达可促进胶原纤维增生，使心肌顺应性降低，这可能是引起慢性心力衰竭者心脏重塑的一个重要原因。此外，提取心肌梗死患者死亡后的心脏组织发现， LOX表达明显上调，且与细胞外基质成分改变及心肌纤维化形成有关[5]。既往我们的研究表明，慢性心力衰竭小鼠心肌组织LOX表达上调，阿托伐他汀可下调慢性心力衰竭小鼠心肌组织LOX，LOX可通过p38及NF-κB信号通路调节MMP-9的表达[6]。

本实验结果表明，对照组大鼠心功能正常；DCM组大鼠心功能恶化，心肌组织胶原纤维、LOX mRNA和蛋白表达明显上调；应用瑞舒伐他汀干预DCM大鼠后，心肌组织胶原纤维、LOX mRNA和蛋白表达下降。实验提示瑞舒伐他汀可逆转DCM大鼠心肌组织胶原纤维及LOX的表达，这可能是瑞舒伐他汀抑制心脏重塑的重要机制。LOX可能是调节心肌组织胶原纤维变化的重要的细胞因子。瑞舒伐他汀可否通过别的细胞因子影响胶原纤维的表达，本研究未涉及。

[1] Li W，Liu G, Chou IN, et a1. Hydrogen peroxide-mediated, lysyl oxidase-dependent chemotaxis of vascular smooth muscle cells[J]. J Cell Biol, 2000, 78(4): 550-557.

[2] Csiszar K. Lysyl Oxidase: a novel multifunctional amine oxidase family [J].Prog Nuclei Acid Res Mol Bio, 2001, 70: 1-32.

[3] Smith-Murgo Li, Kagan HM. Lysyl Oxidase: properties, regulation and multiple functions in biology [J]. Matrix Biol, 1998, 16(7): 387-398.

[4] Lopez B, Querejeta R, Gonzalez A, et al. Impact of treatment on myocardial lysyl oxidase expression and collagen cross-linking in patients with heart failure [J]. Hypertension， 2009, 53(2): 236-242.

[5] Xie Y, Chen J, Han P, et al. Immunohistochemical detection of differentially localized up-regulation of lysyl oxidese and down-regulation of matrix metallopreinase-1 in rhesus monkey model of chronic myocardial infarction [J]. Exp Biol Med， 2012, 237(7): 853-859.

[6] 刘会, 荣季冬, 张曙影, 等．阿托伐他汀对慢性心力衰竭小鼠心肌组织赖氨酰氧化酶表达的影响[J]．中华老年心脑血管病杂志, 2013, 15(6): 628-631．

Effects of rosuvastatin on expression of lysyl oxidase in rat heart with dilated cardiomyopathy

LiuHui1,YangLong1,RongJidong2,JiangZhi,WangJiren.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege, 563003,Guizhou,China.

Objective To explore the effects of rosurvastatin on expression of lysyl oxidase (LOX) in myocardial tissue of rats with dilated cardiomyopathy (DCM).Methods Fifty SD rats were randomly divided into 3 groups which were control group (n=10, equivalent normal saline was intraperitoneal injected), DCM group (n=20, 2.5 mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks), and treatment group (n=20, 2.5mg·kg-1adriamycin was intraperitoneal injected every time, one time every week for 6weeks, gastric lavage in rosurvastain 3 mg·kg-1·d-1at the same time). At the end of week 10, mice were sacrificed, HE and Masson pathological staining, analysis of degree fibering in the myocardial tissue, expression level of LOX mRNA and protein in myocardial tissue of DCM rats were measured by RT-PCR and western blot (WB).Results HE and Masson pathological staining was shown myocardial tissue significantly fibering in DCM group than that in control group, and significantly decreased in treatment group. The expression level of LOX mRNAs and protein were significantly increased in DCM group than that in control group (P<0.01), and were significantly decreased in treatment group than that in DCM group (P<0.01).Conclusion rosurvastatin can attenuate the increased-expression of LOX and fibering in myocardial tissue of DCM rat.

Dilated cardiomyopathy； Protein-lysine 6-oxidese； Rosurvastatin

R-332

A

1000-744X(2016)08-0787-03

2016-03-06)

△通信作者，E-mail：yanglong1001@163.com