氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗2型糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、CD68和MCP-1表达的影响

刘晓伟

(延安大学附属医院，陕西 延安 716000)



氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗2型糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、CD68和MCP-1表达的影响

刘晓伟

(延安大学附属医院，陕西 延安 716000)

目的 探讨氯沙坦钾联合环磷酰胺在治疗2型糖尿病肾病大鼠时对转化生长因子β1(TGF-β1)、CD68和单核细胞趋化因子蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法 选择45只雄性健康SD大鼠，按随机数字表法分为正常对照组、2型糖尿病肾病模型组和氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗组大鼠各15只。造模成功后，观察三组大鼠的血生化指标和肾脏病理学改变等，并采用免疫组化染色比较其TGF-β1、CD68和MCP-1的表达情况。结果 与正常对照组相比，模型组和治疗组的体质量较低，在尿蛋白、血糖、甘油三酯、胆固醇和肌酐等血生化指标以及TGF-β1、CD68和MCP-1表达方面均显著高于对照组，且差异均有统计学意义(P<0. 05)；治疗组与模型组相比，甘油三酯、肌酐以及TGF-β1、CD68和MCP-1表达均较低(P<0. 05)。结论 氯沙坦钾联合环磷酰胺在治疗2型糖尿病肾病大鼠时，可以通过降低肾组织中TGF-β1、CD68和MCP-1的表达水平来降低炎细胞浸润和免疫反应程度，从而延缓糖尿病肾病病情的进展，但是否能用于临床有待于进一步研究。

氯沙坦钾； 环磷酰胺； 糖尿病肾病； TGF-β1； CD68； MCP-1

糖尿病肾病是一种在糖尿病患者中常见的并发症，易演变为终末期肾脏病，并增加心血管疾病发生的风险[1]，因而及时延缓糖尿病肾病病情的进程具有重要意义。研究表明，细胞因子、急性反应蛋白等参与了糖尿病肾病中的炎症反应[2]，降低MCP-1等炎症因子的表达对于改善病情具有重要意义。在本次研究中，探讨了氯沙坦钾联合环磷酰胺在治疗2型糖尿病肾病大鼠时对TGF-β1、CD68和MCP-1的表达影响和其对肾脏保护作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选择45只6周龄SD雄性健康大鼠，体质量200～220 g。按随机数字表方法将45只大鼠随机分为正常对照组、2型糖尿病肾病模型组(模型组)和氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗组(治疗组)，每组15只。

1.2 主要试剂 氯沙坦钾由杭州默沙东制药有限公司生产，注射用环磷酰胺由Baxter Oncology GmbH公司生产；链脲霉素(STZ)由美国Sigma公司提供，TGF-β1多克隆抗体由Santa Cruz公司生产，兔抗大鼠MCP-1由美国PeproTech公司生产，免疫组织化学试剂盒由上海拜力生物科技有限公司生产。

1.3 动物模型的建立和处理 采取常规啮齿类饲料饲养对照组大鼠，并使其自由摄食进水；治疗组和模型组大鼠采取高脂高糖饲料配方(炼猪油、蔗糖、胆固醇和普通饲料按10%、20%、68%的比例配成)饲养。4周后按25 mg/kg剂量对两组大鼠空腹注射链脲霉素混合柠檬酸缓冲液，对照组采取等量缓冲液注射，7 d后进行空腹血糖和葡萄糖耐量实验，以此确定两组的2型糖尿病大鼠；2型糖尿病大鼠在注射STZ后两周检测尿蛋白，若3次为阳性，则为糖尿病肾病大鼠。治疗组的大鼠以氯沙坦钾20 mg·kg-1·d-1剂量灌胃，并以30 mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射环磷酰胺。而正常对照组和模型组的大鼠的灌胃和注射采取等量生理盐水，10周后处死所有大鼠。处死前收集大鼠24 h尿液，并采集4 mL静脉血，离心后冰冻保存。切取双侧肾脏称重，于肾皮质处切取1 mm3肾组织并采用戊二醛固定，常规酒精梯度脱水，石蜡包埋，连续切片。对肾脏切片进行病理学检查和免疫组织化学染色。电镜下随机选择4个视野，以此来计算0.02 mm2的阳性细胞数，取每个视野的平均值。检测所有大鼠的血糖、血肌酐、尿素氮、胆固醇、甘油三酯等水平，大鼠24 h尿白蛋白测定采取酶免疫分析法。

2 结 果

2.1 三组大鼠一般情况和血生化项目比较

2.1.1 三组大鼠一般情况比较 正常对照组体质量(485.19±21.25)g，肾脏重量(3.60±0.35) g，尿蛋白(0.06±0.02) g·24 h-1。模型组体质量(426.64±29.75) g，肾脏重量(3.58±0.39) g，尿蛋白(0.16±0.03) g·24 h-1。治疗组体质量(461.51±30.35) g，肾脏重量(3.67±0.32) g，尿蛋白(0.07±0.06) g·24 h-1。治疗组大鼠体质量重于模型组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。三组大鼠肾脏重量差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 三组大鼠的血生化项目比较 模型组和治疗组大鼠除尿素氮外，其他血生化指标均显著高于正常对照组(P<0.01)。治疗组的甘油三酯和肌酐含量低于模型组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组大鼠的血生化项目比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

2.2 肾脏病理学改变

2.2.1 肾脏光镜改变 光镜下对照组未见病理改变。2型糖尿病各组大鼠的肾小球基底膜变厚，系膜区扩大，管腔较窄，大量的炎细胞浸润。但治疗组与模型组相比，程度较轻。见图1。

图1 模型组和治疗组大鼠肾脏光镜下形态学表现

2.2.2 肾脏电镜改变 对照组大鼠未见病理改变。而2型糖尿病各组大鼠均有不同程度的内皮细胞空泡样变，肾小球基底膜皱缩，脏层上皮细胞肥大，发生足突融合，见图 2。

图2 模型组和治疗组大鼠肾脏电镜下形态学表现

2.2.3 三组大鼠肾脏TGF-β1、CD68和MCP-1表达的变化 TGF-β1、CD68和MCP-1主要在大鼠肾脏肾小管-间质胞浆表达，若呈棕黄色则为阳性。模型组和治疗组的TGF-β1、CD68和MCP-1表达水平较高，且差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组的各项表达低于模型组(P<0.01)。见表2。

表2 三组大鼠肾脏TGF-β1、CD68和MCP-1表达的变化

注：与正常对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，▲▲P<0.01。

3 讨 论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，发病较为隐匿，早期临床表现轻微[3]，而糖尿病亦是导致终末期肾病和心血管疾病的独立危险因素，因此寻找有效的治疗方法有着重要意义。糖尿病肾病的起病原因仍不明确，但有研究表明，受到个体血糖水平、蛋白尿情况和细胞因子等影响，被认为是炎症、免疫反应和巨噬细胞浸润相互作用的结果[4]。TGF-β1是肾小球硬化和肾小管间质纤维化过程中的重要细胞因子，起到趋化、激活单核巨噬细胞并造成细胞外基质过度沉积的作用，可视为炎症发生的标志，其机制是通过TGF-β/Smad通路与靶基因的启动子区域结合从而调控其转录[5]。有文献[6]报道，MCP-1是动脉粥样硬化初期炎症过程的关键因子，可加速肾脏纤维化的发展，在糖尿病肾病的病情进展中起着重要作用。因而抑制肾皮质 TGF-βmRNA表达或下调MCP-1的表达，可以有效降低单核巨噬细胞局部聚集，减少细胞外基质沉积。所以TGF-β1、CD68和MCP-1可作为评估糖尿病肾病进展的依据。研究[7]表明，氯沙坦钾具有降低肾血流灌注压、防止肾小球硬化等作用，因而可以阻止糖尿病肾病病情的进展。有研究发现[8-9]，氯沙坦钾有着降低肾组织MCP-1表达的作用，因而对糖尿病肾病病变大鼠的肾脏起到保护作用。有研究[10]表明，环磷酰胺通过抑制免疫系统细胞的分化、增殖进而影响机体的免疫反应，广泛用于炎症及免疫反应参与的疾病。

本实验结果显示，与正常对照组相比，模型组和氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗组的血糖、24 h尿蛋白明显较高，说明建模成功。模型组和治疗组的TGF-β1、CD68和MCP-1表达明显高于正常对照组(P<0.05)。与模型组相比，治疗组大鼠24 h尿蛋白降低，延缓了肾脏损伤。治疗组TGF-β1、CD68和MCP-1表达明显低于模型组(P<0.05)。治疗组甘油三酯和肌酐含量低于模型组，且差异有统计学意义(P<0.05)。通过观察模型组和治疗组的光镜和电镜图片，可以发现尽管治疗组的大鼠肾组织仍存在病理改变，但其基底膜增厚情况、巨噬细胞和炎细胞浸润程度等方面均较轻。提示在氯沙坦钾联合环磷酰胺治疗后，阻止了巨噬细胞浸润，肾损伤程度明显降低，说明其具有保护肾小球滤过膜完整性和糖尿病大鼠肾脏的作用。

综上所述，本次实验结果表明，氯沙坦钾联合环磷酰胺可以降低2型糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1、CD68和MCP-1的表达水平，降低炎细胞浸润程度和免疫反应，从而延缓糖尿病肾病病情的进展，但在临床上能否用于治疗仍需进行进一步研究。

[1] 李妍妍,陈菊明,王淑玉,等.微量蛋白尿对心血管死亡及全因死亡的预测价值[J].中华糖尿病杂志,2011,3(4):319-323.

[2] 魏平,梁瑞凯,谭明红,等.2型糖尿病肾病大鼠肾脏MCP-1与氧化应激相关性研究[J].第三军医大学学报, 2011, 33(19):2021-2024.

[3] 刘亚.前列地尔治疗糖尿病肾病25例[J].中国药业,2012,21(21):60-61.

[4] 廖钰,夏宁.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].医学综述,2012,17(22):3453-3455.

[5] 于倩,张沫,刘德敏.TGF-β1、CTGF基因的过表达与早期糖尿病肾病关系的研究[J].天津医药,2012,40(3):262-265.

[6] 赵安菊,黄颂敏,欧三桃,等.糖尿病肾病大鼠肾小动脉骨基质蛋白表达及其与MCP-1的关系[J].四川大学学报(医学版),2012,43(3):414-419.

[7] 李瑜琳.前列地尔联合氯沙坦钾治疗糖尿病肾病37例[J].中国药业,2014,23(15):95-96.

[8] 马丽娟,杜国利,吕文魁,等.氯沙坦钾对2型糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1、CD68和MCP-1表达的影响[J].中国病理生理杂志,2012,28(5):948-950.

[9] 陈佳，杨潇，徐利芬，等. 糖尿病大鼠和高糖饮食大鼠肾脏TGF-β1的表达以及形态学变化[J].贵州医药，2008，.32(12)：1059-1063.

[10] 张亚莉,姜莎莎,李燕,等.CTX对2型糖尿病肾病的治疗作用[J].山西医科大学学报,2012,43(8):571-575.

Effects of the expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 by united in Losartan Potassium and CTX therapy in the type 2 diabetic nephropathy renal tissue

LiuXiaowei.

AffiliatedHospitalofYananUniversity,Yuanan716000,Shanxi,China.

Objective To investigate the effects of the expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 by united in Losartan Potassium and CTX therapy in the type 2 diabetic nephropathy renal tissue. Methods Total of 45 SD male rats were randomized into three groups which were the normal control group, type 2 diabetic nephropathy group and Losartan Potassium combined with CTX treatment group (each group was 15 SD). The serum biochemical parameters and renal pathologic featuresin of three groups were observed. The expressions of TGF-β1, CD68 and MCP-1 in the renal tissue were detected by immunohistochemistry staining. Results The body weight of the rats in the model group and treatment group was significantly less than control group (P<0.05). There were statistical significantly differences in the urinary protein, blood glucose, triglyceride, creatinine, cholesterol and the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 between the observation and control groups (P<0.05). And there were statistical significantly differences in triglyceride, creatinineand the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 between the model group and treatment group (P<0.05). Conclusion Losartan Potassium and CTX protects the kidney of diabetic nephropathy rats through inhibiting the expression of TGF-β1, CD68 and MCP-1 in the kidney and restraining macrophage infiltration and the degree and extent of immunoreaction, however, whether it can be used in the clinic that need future research.

Losartan Potassium； CTX； Diabetic nephropathy； TGF-β1； CD68； MCP-1

R-332；R589.1

A

1000-744X(2016)07-0689-03

2016-02-13)