灵芝三萜类化合物对AD大鼠脑海马神经细胞Aβ1-40的影响

张玥 罗俊 黄能慧 张小毅

(贵州医科大学药理学教研室，贵州 贵阳 550004)



灵芝三萜类化合物对AD大鼠脑海马神经细胞Aβ1-40的影响

张玥 罗俊△黄能慧 张小毅

(贵州医科大学药理学教研室，贵州 贵阳 550004)

目的 研究灵芝三萜类化合物(GLT)对阿尔茨海默病(AD)大鼠脑海马神经细胞Aβ1-40表达的影响。方法 将自然衰老模型大鼠60只随机均分为六组：模型组，GLT低、中、高剂量组，溶媒对照组(食用油)及阳性对照组(健脑胶囊)，5个月龄大鼠10只为正常对照组。连续灌胃给药60 d后，免疫组化法检测海马Aβ1-40表达。结果 模型组海马神经细胞Aβ1-40表达增多，GLT组Aβ1-40表达减少。结论 GLT有防治AD的作用，其作用机制可能与减轻Aβ的神经毒性以及减少脑内Aβ沉积有关。

灵芝三萜类化合物； 阿尔茨海默病； 自然衰老； β-淀粉样肽

阿尔茨海默病(alzheimer disease,AD)是一种神经系统退行性疾病，已成为仅次于心血管疾病、肿瘤、脑卒中的第4位死因。AD起病潜隐，主要表现为严重的认知和记忆功能减退等[1]。AD病因不明，缺乏有效的防治手段。除了使用脑细胞代谢激活剂和其他一些药物外，对该病的中药治疗也开始研究[2]。本课题组曾在国内首次应用灵芝主要有效成分GLT(ganoderma Lucidum triterpenoids)进行防治AD的研究。本文拟观察GLT对AD模型大鼠脑海马神经细胞Aβ1-40(β-Amyloid1-40)表达的影响，以深入探讨其防治AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及实验动物 GLT(中科院地化所提取)，健脑胶囊(JNJN，青岛国风药业公司)，ANTI-β-Amyloid(1-40)(武汉 BOSTER公司)，BIOMIAS-99图像分析系统(四川大学图像图形研究所)。SD大鼠由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.2 动物分组及方法 取24月龄大鼠100只，5月龄大鼠10只，进行Morris水迷宫实验，以后者逃避潜伏期均数+2倍标准差为标准，24月龄大鼠大于该值的为AD大鼠[3]。筛选出的60只AD大鼠随机分为六组，每组10只，雌雄各半。1次/d灌胃给药，连续60 d。模型组(NS 10 mL/kg)、溶媒对照组(食用油 10 mL/kg)、GLT低、中、高剂量组(0.25g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)及阳性对照组(JNJN 0.38 g/kg)。5月龄大鼠为正常对照组(NS 10 mL/kg)。

给药结束后迅速于冰台上0 ℃下断头取出大脑。取视交叉后5 mm厚的冠状位脑片(包含海马)，石蜡包埋，连续冠状切片，用于分析海马神经细胞Aβ1-40的表达水平(按试剂盒操作)。用BIOMIAS-99图像分析系统进行分析。每张切片随机选取5个视野(400倍)，每个视野选取5个阳性表达区域，测量平均灰度值(mean gradation，MG)，以5个视野MG平均值代表其阳性表达率。

2 结 果

模型组大鼠的海马神经元胞浆呈深染棕黄色颗粒状改变，经图像分析测定，模型组MG(81.82±3.80)及溶媒组MG(84.71±4.52)较正常对照组MG(190.56±4.68)显著降低(P<0.01)，提示Aβ1-40的表达增多，神经毒性增强；与模型组比较，GLT低、中、高剂量组大鼠海马神经元胞浆呈浅染棕黄色颗粒状改变，GLT低、中、高剂量组及阳性对照组MG较模型组显著增高(P<0.01)，分别为(124.74±4.31)、(149.97±5.73)、(177.57±5.91)、(88.11±4.48)，提示Aβ1-40的表达减少，神经毒性减弱，见图1。

图1 GLT对自然衰老模型大鼠海马Aβ1-40表达的影响 (×400)

3 讨 论

AD的发病机制据研究可能与脑内Aβ沉积、胆碱能传递功能紊乱、自由基损伤等因素有关。AD是氧化应激诱导的蛋白质代谢紊乱，Aβ是负面效应的核心分子。习惯所称灵芝属中赤芝的子实体部分。灵芝具有广泛的药理活性，主要有效成分之一是GLT[4-6]，本文旨在观察GLT对AD大鼠脑神经细胞Aβ1-40的影响，研究该药对AD有无防治功能，并探讨其可能的作用机制。

AD的病理学改变有老年斑、神经元纤维缠结、大量神经元丢失及颗粒空泡变性等，聚集的Aβ具有神经毒性作用，Aβ沉积是AD的主要发病因素[7]。建立理想的模型是研究的重要环节，而本研究采用自然衰老认知障碍模型，更符合衰老因素在AD发病过程中的重要作用[8]，在组织病理学以及神经生物化学变化方面模拟出与AD相似的特征。本研究结果表明：与正常对照组相比，自然衰老模型大鼠海马神经元胞浆呈深染棕黄色颗粒状改变，Aβ1-40表达明显增多，神经毒性增强。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)及前体类似物等经蛋白酶分解后的产物，APP是存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，广泛存在于各种组织中，但只有在神经元中，APP才易裂解产生Aβ。正常代谢情况下APP被α分泌酶水解，生成可溶性分泌型APP(sAPPα)，sAPPα可以保护神经元免受兴奋性毒素和氧化反应损伤；异常情况下，β分泌酶裂解APP产生一个sAPPβ片段，剩下的羧基端肽段在γ分泌酶作用下产生Aβ(80%～90%的Aβ1-40和10%～20%的Aβ1-42)。产生的Aβ，其1/3左右的序列位于APP的跨膜结构域，由于其跨膜区的疏水性，使Aβ易于聚集沉积导致SP出现[9]。予GLT灌胃两个月后，与模型组比较，GLT低、中、高剂量组及阳性药组大鼠海马神经元胞浆呈浅染棕黄色颗粒状改变，Aβ1-40表达减少，神经毒性减弱，提示GLT有一定程度的对抗Aβ神经损伤的作用。本文结果表明GLT有防治AD的作用，其作用机制可能与减轻Aβ的神经毒性以及减少脑内Aβ沉积有关。

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Effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer disease of the model animals through Ganoderma Lucidum Triterpenoids

ZhangYue,LuoJun,HuangNenghui，ZhangXiaoyi.

DepartmentofPharmachology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China

Objective To observe the effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer Disease (AD) of model animals by used the Ganoderma Lucidum Triterpenoids (GLT).Methods 60 natural aging rats were randomly divided into 6 groups which were GLT low dose group, GLT middle dose group, GLT high dose group, model group, solvent group (oil), and positive group (JNJN). Then the intragastric administration was used. After being treated with GLT for 60 days, the expression of Aβ1-40in hippocampus was tested by immunohistochemistry.Results The expression of Aβ1-40in hippocampus increased in model rats, while GLT group significantly decreased. Conclusion GLT can protect AD model animals, and the following mechanisms may be decreasing the deposition of Aβ.

Ganoderma Lucidum Triterpenoids; Alzheimer disease; Natural aging; β-Amyloid

教育部科学技术研究重点项目(V200801);贵州省科技攻关项目(黔科合2004NGY031);贵州省优秀科技教育人才省长专项资金(2005293)

R285.5

A

1000-744X(2016)07-0681-02

2016-04-25)

△通信作者