miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表达及临床意义

俞进友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龙

(南通大学附属建湖医院肿瘤中心肿瘤内科，江苏 南通 224700)



miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表达及临床意义

俞进友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龙△

(南通大学附属建湖医院肿瘤中心肿瘤内科，江苏 南通 224700)

目的 探讨microRNA-10b(miR-10b)、microRNA-145(miR-145)及microRNA-155(miR-155)在乳腺癌患者病理组织及血清中的表达水平，进而评价其在乳腺癌诊断中的价值。方法 收集100例正常健康志愿者，150例乳腺癌患者血液和39例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织，提取血液和组织中的microRNA，采用实时荧光定量PCR检测miR-10b、miR-145及miR-155表达水平，分析其与乳腺癌患者临床病理参数之间的相关性,并绘制ROC曲线分析其在乳腺癌诊断中的价值。结果 治疗前乳腺癌患者血清中的miR-10b，miR-145和miR-155表达水平高于对照组(P<0.05)，三者表达水平均与肿瘤转移显著相关，与年龄、组织学特征、ER表达无相关性(P>0.05)miR-10 b与临床分期显著相关(P<0.05)，miR-10b的ROC曲线下面积为0.936，miR-145的ROC曲线下面积为0.904，miR-155的ROC曲线下面积为0.91。miR-10b，miR-145，miR155在Ⅲ级乳腺癌患者肿瘤组织的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ级乳腺癌患者癌组织的表达水平(P<0.05)。结论 血清中miR-10 b、miR-145及miR-155有可能作为乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物。

microRNA； 乳腺癌； 肿瘤分期

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。我国新诊断乳腺癌患者占世界乳腺癌患者12.2%[1]，严重危害妇女健康。乳腺癌的发生、发展涉及诸多因素，而基因水平的表达变化则是最为重要的调控因素[2]，miRNA在微观水平上调控着乳腺癌的发生和发展。miRNA是一类内源性非编码的小RNA ，广泛存在于动物、植物和病毒中，通过与目标mRNA的3'UTR序列互补配对，调控靶基因的表达或翻译，参与生物体的发育、炎症、肿瘤等多种生理、病理过程[3]。最近发现miRNA在乳腺癌中表达谱的研究提示其可能成为一种新的疾病诊断、分类和预后判断的工具。miR-10b作为miRNA家族中的一员，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤组织中均存在异常表达，并且与肿瘤的侵袭及远处转移有密切关系。miR-145在乳腺癌组织中表达异常，且与病理分级、淋巴结转移、肿瘤大小有关。miR-155是最早被发现的具有促癌活性的miRNA，不仅在乳腺癌内表达增高，而且可以促进体内外乳腺癌细胞的增殖和生长[4]。血浆中也存在miR-155，其能够对抗核糖核酸酶的降解而保持稳定性，这表明血液循环中的miR-155有可能成为新一代的乳腺癌肿瘤标志物[5]。然而这三个miRNA在中国人群中研究不多，本研究采用实时荧光定量PCR方法，检测中国人群血清中miR-10b、miR-145及miR-155的表达水平，分析其与乳腺癌临床病理特征之间是否存在可靠的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2014年6月至2014年12月于我院就诊的150例乳腺癌患者作为病例组，抽取外周血样本，其中39例另有蜡块切片样本，所有病例均经过病理学诊断证实，并附有详细的病理资料。取这一时段内至医院体检健康人外周血样本100份作为对照组。病例组中，年龄22～75岁，平均年龄52岁，两组样本在性别、年龄等人口学资料上差异无统计学意义(P>0.05)。乳腺癌患者均按 WHO乳腺肿瘤分类标准进行病理学分型，在采集血液标本前均未经手术，未经放、化疗，且无炎症等合并症。本研究获得医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司； All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit试剂盒购于广州复能基因有限公司；Real-Time PCR试剂盒购自Promega公司；miR-10b、miR-145、miR-155引物购自广州复能基因有限公司(has-miR-10b-5p引物货号HmiRQP0034，hsa-miR-145-5 p引物货号HmiRQP0192，hsa-miR-155-5 p引物货号HmiRQP0221)。人miRNA外参及外参检测引物购自天根生化科技(北京)有限公司(miRNA外参货号CR100-01，miRNA外参检测引物货号CD100-01)。

1.2.2 提取血液总RNA 每份取200 μL血清，加入等量的人miRNA外参，严格按照总RNA提取试剂盒说明书进行，按RNA量加入DEPC水溶解RNA。核酸蛋白定量仪上测定RNA溶液D260/D280吸光值，计算RNA浓度和纯度，D260/D280比值介于1.8～2.0方可用于cDNA合成。2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。取少量定量后的RNA稀释为1 μg/μL用于逆转录。其余RNA立即存放于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 miRNA的逆转录 使用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit试剂盒进行逆转录。模板RNA 浓度调至40 ng/μL管加入2.5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 5 μL、RNase/Dnase free water补足至25μL体系。PCR仪中设定以下程序进行反转录：Step1：37 ℃，60min；Step2：70 ℃，15min。

1.2.4 miRNA 的实时荧光定量检测 用实时荧光定量 PCR 方法检测miR-10b、miR-145、miR-155及外参在血清中的表达情况。荧光定量PCR采用20 μL的反应体系，每孔加入2×Mix 10 μL、特异引物2 μL、通用引物(2 μM) 2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 4 μL。每管设3个复孔。反应条件为：95 ℃ 预变性10 min，95 ℃变性10 s，Tm-2 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。

1.3 统计学方法 microRNA的相对表达量以 2-ΔΔCt法计算，公式: ΔΔCt =[(样本 CtmicroRNA-样本 Ct外参)-(对照组 CtmicroRNA-对照组Ct外参)]。组间比较采用t检测，以P<0.05为差异有统计学意义。采用受试者工作曲线(ROC曲线)及曲线下面积(AUC)评价miR-10b、miR-145及miR-155作为一种诊断方法的临床应用价值。

2 结 果

2.1 miR-10b、miR-145及miR-155在乳腺癌患者与健康人血清中表达差异 荧光定量PCR检测乳腺癌患者与健康对照组血清中的miRNA的表达水平，三种miRNA在乳腺癌患者血清中表达水平均上升，miR-10 b在病例组患者血清中的表达水平为[(6.824±0.194)，对照组标准化为1]，miR-145在病例组患者血清中的表达水平为[(10.110±0.305),对照组标准化为1]，miR-155在病例组患者血清中的表达水平为[(13.233±0.641)，对照组标准化为1]，与对照组相比，P均<0.01,差异有统计学意义。

2.2 ROC曲线分析血清miR-10b、miR-145及miR-155对乳腺癌患者的诊断价值 以灵敏度为纵坐标，误诊率(100-特异度)为横坐标在SPSS软件上绘制ROC曲线图，然后计算曲线下面积(AUC)。miR-10 b ROC曲线中AUC=0.936; miR-145 ROC曲线中AUC=0. 904，miR-155 ROC曲线中AUC=0.91，miR-10b、miR-145及miR-155对乳腺癌的诊断均有很好的准确性。

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155的表达水平与乳腺癌临床病理参数的关系 乳腺癌患者血清中miR-10 b相对表达量与临床TNM分期有显著相关性(P<0.05)， M期患者血清中miR-10b相对表达量高于T、N期;而乳腺癌患者血清中miR-145与miR-155相对表达量与临床TNM分期无显著相关性(P>0.05);有淋巴结转移患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155的相对表达水平高于无淋巴结转移患者(P<0. 05) ; 乳腺癌患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155相对表达量与年龄、组织学特征、雌激素受体状态无明显相关性(P>0.05)，见表1。

表1 血清 miR-10b、 miR-145、miR-155表达水平与乳腺癌患者临床病例参数的关系

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155在不同病理分级乳腺癌组织中的表达 荧光定量PCR检测乳腺癌病理组织中miR-10b、miR-145、miR-155的相对表达量，Ⅲ级乳腺癌病理组织中miR-10b、miR-145、miR-155相对表达量高于Ⅰ～Ⅱ级患者，呈正相关，其中miR-155与病理分级相关性最好，病理分级越高，表达量越高。

3 讨 论

miRNA是一类长约22～25 bp的核糖核酸分子，miRNA能够识别靶基因的3’UTR区，负向调控靶基因mRNA的降解，进而调节靶基因的功能。血液中循环miRNA具有很好的稳定性，可作为肿瘤诊断的生物标志物。

miRNA在多种恶性肿瘤中都有差异性表达，而且表达水平与组织病理学特征以及疾病的不同阶段之间存在着密切关系。血液循环中的miRNA是由肿瘤细胞选择性分泌的，肿瘤细胞与正常组织细胞之间miRNA的表达谱存在巨大差异。miRNA在肿瘤发生过程中起到类似于癌基因或抑癌基因的作用，肿瘤细胞中miRNA表达水平上调，则视为癌基因，反之则视为抑癌基因。本实验选取的三个miRNA在血清中表达水平均上调，而肿瘤组织中miR-155与肿瘤的病理分级呈正相关，在肿瘤的发展过程中有正向调节作用。因为miRNA 在组织及血液中相对表达量甚微，实验选取的三指标上调，相对于负向调节作用的miRNA，更容易被检测到，为miR-10b、miR-145和miR-155成为乳腺癌肿瘤标记物提供了帮助。同时，本实验采用添加miRNA外参检测的方法，排除了常见内参(U6)的差异带来的影响，增加了检测结果的准确性[6]。

本研究发现，与健康对照组相比，miR-10b、miR-145和miR-155在乳腺癌患者血清中表达均明显上调，三种miRNA表达水平均与肿瘤转移显著相关，但与年龄、组织学特征、ER表达无相关性，表明三种miRNA参与到肿瘤的转移过程中，但需要增加检测临床样本量，同时详尽的分子机制有待后续研究[7]。本研究还发现miR-10b与临床分期显著相关，M期乳腺癌患者血清中miR-10b的相对表达量明显高于T、N期患者，但miR-145和miR-155却与临床分期无相关性。miR-145的ROC曲线下面积为0.936，miR-155的ROC曲线下面积为0.904，miR-10b的ROC曲线下面积为0.91，均高于0.9，表明三种miRNA具有很高的诊断价值。同时我们检测发现，miR-10b，miR-145和miR-155在病理Ⅲ级乳腺癌患者肿瘤组织的表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ级乳腺癌患者癌组织的表达水平(P<0.05)，miR-155在乳腺癌患者肿瘤组织的表达水平与分期相关，病理分级越高，miR-155相对表达水平越高。miR-10 b、miR-145和miR-155的在乳腺癌患者血清中表达水平与乳腺癌的临床病理标本并不一致。综上所述，miR-10b、miR-145和miR-155可能成为新一代的乳腺癌肿瘤标志物。

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Clinical significance and expression level of microRNA-10b and microRNA-145 and microRNA-155 in the patients with breast cancer

YuJinyou,QiuJianling,ZhuZhengfeng,ZhouYing,GuWenlong.

DepartmentofInternalMedicine,AffiliatedofJianhuHospitalTumorCenter,NantongUniversityinJiangsu.Nantong224700,Jiangshu,China.

Objective To investigate the expression level of microRNA-10b(miR-10b), microRNA-145(miR-145)and microRNA-155(miR-155)in the pathological tissue and serum of patients with breast cancer, and to evaluate its value in the diagnosis of breast cancer. Methods Peripheral blood was collected from 100 healthy volunteers and 150 patients with breast cancer, and cancer tissue and adjacent tissue in 39 patients with breast cancer were collected. The expression levels of miR-145 and miR-10b were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Then the correlation between the trend of miR-10b，miR-145 and miR-155 in serum and in tumor tissue was analyzed. Results The expression level of miR-10b, miR-145 and miR-10b in serum of patients with breast cancer was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expression of three microRNAs were associated with tumor metastasis and not correlated with age, histological features and the expression of ER. The expression of miR-10b was significantly correlated with the clinical staging (P< 0.05), the area under ROC curve of miR-10b, miR-145 and miR-155 was respectively 0.936, 0.904 and 0.91. The expression of miR-10b, miR-145 and miR-155 in the breast cancer tumor tissue with stage Ⅲ was significantly higher than that of breast cancer tissue with Ⅰ～Ⅱ stage. Conclusion miR-10b, miR-145 and miR-155 may be used as tumor markers in early diagnosis of breast cancer.

microRNA； Breast cancer； Tumor stage

江苏省卫计委2014年重大课题招标项目 (项目编号YG201418)

R737.9

A

1000-744X(2016)07-0683-03

2016-04-07)

△通信作者