丹皮酚和三七总皂苷联合应用对心梗后心室重构大鼠心肌组织TNF-α表达的影响

范彦芳，李前宽，周晓慧，曹 凯

(承德医学院，承德 067000)

丹皮酚和三七总皂苷联合应用对心梗后心室重构大鼠心肌组织TNF-α表达的影响

范彦芳，李前宽，周晓慧，曹 凯*

(承德医学院，承德 067000)

目的：探讨丹皮酚、三七总皂苷联合应用对心肌梗死后心室重构大鼠心肌组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响。方法：结扎左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死大鼠动物模型；将存活且造模成功的大鼠随机分成模型组、丹皮酚组、三七总皂苷组、丹皮酚与三七总皂苷联合用药低剂量组、高剂量组和卡托普利组，另立假手术组。连续给药4周，Masson染色检测各心肌组织胶原容积分数(CVF)，Western-blot检测心肌组织中TNF-α蛋白的表达水平。结果：与模型组比较，各用药组CVF和TNF-α蛋白表达不同程度降低；与单味药丹皮酚组和三七总皂苷组比较，联合用药组CVF和TNF-α蛋白表达下调显著，联合用药高剂量组较联合用药低剂量组作用更显著。结论：丹皮酚与三七总皂苷联合应用可协同下调TNF-α蛋白表达，改善心室重构。

丹皮酚，三七总皂苷，联合用药，心室重构，TNF-α

心室重构是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后心肌组织的基因表达、结构、代谢及功能发生模式上的改变重建的一个过程，包括心肌细胞的肥厚、长宽比例发生变化，收缩功能下降，逐渐变性和坏死，心肌间质发生纤维化，细胞外基质胶原网的量和质的改变。此病理改变是导致慢性心衰的关键环节[1，2]。因此，抑制心梗后的心室重构可抑制或延缓心力衰竭的发生和发展。丹皮酚(paeonol，Pae)从中药萝藦科植物徐长卿和毛茛科植物牡丹的茎和根皮中分离而来，有抗炎、抗心律失常、保护心血管等药理作用[3]。三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是五加科植物三七的主要有效成分，广泛应用于心脑血管疾病[4]。本研究旨在确证二者联合应用是否能够协同影响TNF-α的表达，改善心梗后心室重构。

1 资料与方法

1.1 实验动物和试剂 健康SPF级雄性SD大鼠80只，体质量180～220 g(北京维通利华，许可证号SCXK[京]2012-0001)。丹皮酚注射液(天真制药，批号20110603)；血塞通注射液(成分是三七总皂苷，昆明制药，批号13CJ27)；卡托普利片(开封制药，批号H41022498)；Masson染色试剂盒(福州迈新)；β-action、TNF-α蛋白抗体(美国Santa cruze公司)。小型动物呼吸机(淮北正华，DW3000-B)，电泳仪(北京市六一仪器厂，DYY-BC)。

1.2 方法

1.2.1 AMI模型制备及分组 80只SD大鼠中随机选取10只，穿线不结扎左冠状动脉前降支为假手术组。剩余70只结扎心脏左冠状动脉前降支制备AMI模型，心电图显示ST段呈弓背向上型抬高至少1/2，标志AMI模型建立成功[5]。手术3 d后，将成模大鼠随机分成丹皮酚组(腹腔注射8 mg/kg)、三七总皂苷组(腹腔注射40 mg/kg)、联合低剂量组(腹腔注射丹皮酚4 mg/kg +三七总皂苷20 mg/kg)、联合高剂量组(腹腔注射丹皮酚8 mg/kg +三七总皂苷40 mg/kg)、卡托普利组(10 mg/kg灌胃)、模型组和假手术组(腹腔注射等体积生理盐水)。1次/d，连续给药28 d取材。水合氯醛(4%)腹腔麻醉大鼠，快速开胸取出心脏，切取梗死心脏组织一部分固定在10%中性福尔马林缓冲液中，常规石蜡脱水包埋，制成蜡块，以备形态学的观察；另一部分冻存于-80 ℃冰箱中，以备Western-blot蛋白表达的测定。

1.2.2 Masson染色 取心脏横切面4 μm连续切片5张，染色步骤参照Masson染色试剂盒所附说明书，染色时间适当调整。光学显微镜下可见胶原纤维蓝染，肌肉红染。每张石蜡切片200倍显微镜下随机选取观察5个视野拍照后采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定CVF[CVF=胶原面积/(心肌面积+胶原面积)]，观察各组心肌纤维化程度。

1.2.3 Western blot法检测TNF-α 蛋白表达 在低温环境中，提取心肌组织总蛋白，BCA法进行含量测定，绘制标准曲线并推导演算蛋白浓度，计算上样量，95 ℃水浴5 min蛋白变性。12%SDS-PAGE凝胶稳压电泳，冰中130 mA稳流转膜，5%脱脂奶粉和TBST混合液4 ℃封闭过夜。次日室温摇床上一抗孵育2 h，TBST洗膜15 min/次，3次；二抗孵育2 h，TBST洗膜5 min/次，3次；暗室中避光显影、定影。用Quantity One软件扫描目的蛋白和β-action条带的灰度值，用其比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 Masson染色结果 对照假手术组，模型组胶原纤维结缔组织严重增生成网状，排布紊乱，大量纤维瘢痕形成，CVF值明显升高(P<0.01)。与模型组相比，各给药组的病理改变均有不同程度的改善，巨检均无大量胶原纤维网和瘢痕，CVF值不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)其中联合高剂量组最明显。见图1和表1。

A.假手术组 B.模型组 C.卡托普利组 D.Pae组 E.PNS组 F.联合高剂量组 G.联合低剂量组图1 Massom染色(×200)

2.2 大鼠心肌组织TNF-α 蛋白的表达水平 与假手术组相比，模型组TNF-α 蛋白的表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，各用药组蛋白的表达量均明显降低(P<0.01)；联合用药组较丹皮酚和三七总皂苷单味给药组降低显著(P<0.01)；联合高剂量组较联合低剂量组降低更加明显(P<0.01)。结果见图2和表1。

A.假手术组 B.模型组 C.卡托普利组 D.Pae组 E.PNS组 F.联合高剂量组 G.联合低剂量组图2 各组大鼠心肌中TNF-α 的蛋白表达表1 各组大鼠心肌中 CVF和TNF-α 蛋白的表达

组别动物数CVF(%)TNF-α蛋白表达假手术1014．75±4．930．93±0．03模型845．96±8．32a2．13±0．10a卡托普利920．57±5．29b1．06±0．05bPae934．13±3．54b1．79±0．02bPNS931．45±3．54b1．67±0．04b联合高剂量919．82±4．57bcef1．20±0．05bceg联合低剂量927．41±5．36bcd1．57±0．04bce

注：与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01；与Pae比较，cP<0.01；与PNS比较，dP<0.05，eP<0.01；与联合低剂量比较，fP<0.05，gP<0.01。

3 讨论

近年调查显示心肌梗死的发病率一路攀升，严重威胁了人类的健康。心室重构是心肌梗死发生后，心脏自身为保持有效心功能而产生的代偿反应，为修复已发生的病理改变使心室壁形态结构改建的过程。但持续的心室重构会使心室壁进行性扩张，功能逐渐衰退，是导致心力衰竭而致死亡的主导原因[6]。AMI后心室重构的病理机制复杂多元，研究表明，炎症信号通路、细胞凋亡、SNS和RAAS都与心室重构的发生密切相关。其中炎症通路的激活进而诱导炎症细胞因子过量表达是心室重构发生和发展的主要机制。因此，减轻炎症细胞因子对心功能的损害显得尤其重要[7]。

TNF-α 是常见的炎性细胞因子，有研究显示AMI后，TNF-α 可通过NF-κB 炎症途径激活表达量增加，过量的TNF-α 又进一步上调NF-кB的靶基因促进其活化，进而形成细胞因子激活的正反馈通路和恶性循环。抑制心肌收缩，促进胶原的分泌和成纤维细胞的增殖，加速心室重塑。导致心力衰竭，抑制TNF-α 的表达，能够减缓心室重构的发展[8，9]。

本研究结果证实，实验大鼠AMI后心肌发生了纤维化，组织坏死严重，细胞间质胶原纤维沉积，TNF-α 表达明显升高。各用药组同模型组相比，心肌组织坏死有明显减轻，CVF明显降低，TNF-α 表达量显著减少。可见，丹皮酚和三七总皂苷均可改善心肌梗死后的心室重构，分子机制可能与下调TNF-α 蛋白表达有关。且与单味药相比较，联合用药组效果更显著，且联合高剂量组效果优于低剂量组，两药合用协同作用明显呈现。

1 Sutton M G, Sharpe N. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy[J]. Circulation, 2000, 101(25):2981-2988

2 Jessup M, Brozena S. Heart failure[J]. N Engl J Med，2003, 348(20): 2007- 2018

3 胡云飞,徐国兵.牡丹皮及其主要成分丹皮酚的药理作用研究进展[J].安徽医药, 2014, 18(4):589-592

4 武双,崔秀明,郭从亮,等.三七“生打熟补”物质基础及药理作用研究进展[J].安徽农业科学,2015,43(8):50-53

5 Cheng K, Malliaras K, Shen D,etal. Intramyocardial injection of platelet gel promotes endogenous repair and augments cardiac function in rats with myocardial infarction[J]. Am Coll Cardiol, 2012, 59(3): 256-264

6 周晓慧,赵静怡,张树峰,等.丹皮酚通过抑制NF-κB信号通路下调MMP-9的表达改善心梗后大鼠的心室重构[J].中成药,2014,36(12):2599-2602

7 Parish R C, Evans J D. Inflammation in chornic heart failure[J]. Ann Pharmacother, 2008, 42(7):1002-1016

8 Gurantz D, Cowling R T, Varki N,etal. IL-1beta and TNF-alpha up regulate angiotensin Ⅱ type 1 (AT1) receptors on cardiac fibroblasts and are associated with increased AT1 density in the post-MI heart[J]. Mol Cell Cardiol, 2005, 38(3): 505-515

9 Monaco C, Andreakos E, Kiriakidis S,etal. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2004, 101(15): 5634-5639

Effects of paeonol combined with PNS on TNF-αexpression in rats with ventricular remodeling after myocardial infarction

Fan Yanfang, Li Qiankuan, Zhou Xiaohui,Cao Kai

(Chengde Medical College，Chengde 067000)

Objective： To investigate the effects of paeonol(Pae) combined with PNS on TNF-α expression in rats with ventricular remodeling after acute myocardial infarction(AMI). Methods： AMI model was made by ligaturing left descending coronary artery. Alive rats with AMI were randomly divided into model group, Pae treated group, PNS treated group, Pae plus PNS treated groups and the positive control group with captopril and the sham operation group. Collagen volume fraction(CVF)by Masson staining and expression of TNF-αwas detected by Western blot assay after four-week，treatments in all groups. Results： Compared with the model group, CVF and the levels of TNF-αreduced to various extents. In Pae plus PNS groups, CVF was lower and the expression of TNF-αwas down-regulated more than in Pae or in PNS group. the effects were more significant in combination of high-dose group than low-dose group. The inhibiting effects were more significant when Pae and PNS were given at higher doses. Conclusions： The combination of Pae and PNS can play an obvious synergistic action in inhibiting ventricular remodeling in AMI rats by down-regulation of TNF-αexpression.

paeonol,PNS, durg combination, ventricular remodeling, TNF-α

2016-09-21

河北省自然科学基金项目(No.C2011406009)，河北省教育厅重点项目(No.ZD20131068)

R967

A

1006-5687(2016)06-0009-03

*通讯作者：曹凯，E-mail：caokai58@163.com。